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标题:【求助】western本底高原因

popo520[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western本底高原因


western已经做了很长时间了，actin一直很好，但同时做的目的蛋白本底总是很高，二抗浓度已经摸了好多遍，但总是效果不好，极度郁闷中！！！请高手帮忙分析一下！另外有一个问题，是否针对不同的目的蛋白，即使是用同一种二抗，浓度也会有很大的区别， 我现在actin用1：3000，而目的蛋白已经摸到1：10000了还不行
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的是ECL还是DAB啊，在降低二抗浓度的同时，如果是ECL显色可以缩短曝光时间和显影时间，DAB的话就注意一下显影时间。还有一个和背景有关的主要因素就是一抗，如果是单抗背景肯定会低，如果是多抗背景会深，只能在做的过程中将各个因素优化到理想的结果。actin大多都是一抗，且表达量高，所以背景与二抗的浓度关系不是太大，而大多目的蛋白都是多抗，在实验的过程中就要注意二抗的问题了。
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发表于 2014-2-10 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 popo520 于 2014-2-10 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

western已经做了很长时间了，actin一直很好，但同时做的目的蛋白本底总是很高，二抗浓度已经摸了好多遍，但总是效果不好，极度郁闷中！！！请高手帮忙分析一下！另外有一个问题，是否针对不同的目的蛋白，即使是用同一种二抗，浓度也会有很 ...

1. actin是单抗，所以二抗浓度高一点没有什么问题。只要蛋白上样量不要太高就行。
如果目的蛋白是多抗，有时候二抗的浓度就需要摸索。
我actin1：5000；目的蛋白（都是多抗）有的是 1：5000，有的用1：10000，最多1：20000。
2. 背景高，可以降低一下上样蛋白量（30ug试试）；减少一抗 二抗的孵育时间(可以尝试室温下各1h)。
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的建议是二抗孵育后的洗涤要充分，如果你是3次10min洗涤，可以考虑变成5次5分钟。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以换一种ECL液试一试，有些公司的ECL液太敏感了，背景比较高。
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婴儿脸[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2014-2-10 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以换一种ECL液试一试，有些公司的ECL液太敏感了，背景比较高。

同意楼上的，如Millopore的ECL就比Pierce的敏感的多。往往用Pierce曝不出条带的时候， 再用Millipore的也能曝出来。
所以，M公司ECL显色试剂盒上写着 更加节省抗体。
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popo520[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢大家，现在问题已经解决了，说一下我的改进措施。封闭液用脱脂奶粉加1%tween20，一抗孵育后test洗三次，每次15分钟，二抗浓度还保持不变，用的是ECL显色
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