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标题:【求助】双向电泳只有5，6个点，是蛋白提取出现了问题吗？

ha111[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】双向电泳只有5，6个点，是蛋白提取出现了问题吗？


各位研究蛋白质组学的战友，我做的是大豆叶片蛋白质组，提取的方法是TCA丙酮法，裂解液组分为（9M Urea，2M Thiourea，100mM DTT，4％CHAPS，0.5％CA），用的是伯乐公司7cm,PH3-10的胶条，但是跑出来的点只有几个，在左下角靠近3那端，其它的地方都是白板，朋友说可能是蛋白提取过程中损失太多所导致的，也可能和聚焦过程有关，摸索了一个月了，到底是什么原因还是没有找到。 迷惑中，希望高人指点迷津
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一篇老外的文章也做过大豆叶片的蛋白质组， 提取方法也是TCA丙酮法， 裂解液组分为9M尿素，1% 的CHAPS，1%DTT，1% 两性电解质，只不过用的是安玛西亚的仪器，我看他的点就非常好，文章太大不能放在在附件中，有兴趣的战友可以留下email，共同研究。到底是什么问题呢，迷惑中。。。。。
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看你说跑出来几个点，应该胶总的来说还是清楚的吧，聚焦应该不是最主要的原因
可能是你研得不够充分？
而且我没看到你的裂解液中有两性电解质呀，可能是这个原因，你加入1%的两性电解质试试吧，祝好运
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

研磨了半个小时 ，泛白色 ，在 -80冰箱保存了两个月，应该影响不是很大吧。CA那个就是两性电解质，我看资料用0.5%的就很大了 ，1%可以吗 ？
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

研磨半小时，有点夸张吧
ＣＡ我还真不知道是两性电解质呀，呵呵
１%可以的
裂解液要加得适量，不能太少，最好也不要太多
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在上样之前蛋白质有没有定量啊，定量的方法有没有问题呢
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发表于 2014-2-10 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
研磨了半个小时好像时间是有点长，师姐做玉米叶片的，研了半个小时，我就参考了一下。现在想是不是研磨时间太长使蛋白损失了呢？ 玉米的叶片要比大豆叶片坚硬了很多。我用的是0.01克蛋白干粉加500微升裂解液，但是效果不是很好，失败的原因可能有很多，所以每个地方都要考虑，累！
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发表于 2014-2-10 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有定量，个人认为蛋白定量还是定不准确，所以先跑了几板试试看，7厘米胶条上样量为80微升和100微升时只有4，5个点，昨天上到了130微升，点多了一些，图片我会尽快上传。所以我更觉得是蛋白提取过程损失太多，不知道是否有同感。
谢谢二位热心帮助，祝顺！
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发表于 2014-2-10 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是跑的两张图，一张几乎没有点，只有纵条纹，另一张总算出来了点，但是也不是很清楚。 两次不同之处：1、上样量不同。没有点的那张上了100微升，有点那张上了130微升。2、我的一个朋友做番茄的，他的出点了，但是一次和我一起跑用的是我的二向胶，其他的条件都没有变，结果却没有出来点，也是只有几个点和纵条纹，所以怀疑我的二向胶有问题，这次是用他的胶跑的，结果出点了。请问各位，没有出点有没有可能是二向胶的问题呢？我看药也没有错啊，都是刚买的，胶也凝了啊
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-2-10 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以减少上样量试试，可能高峰度的出来的，其它还没出来吧
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