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标题:【求助】关于蛋白质组学的几个问题

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发表于 2014-2-10 20:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于蛋白质组学的几个问题


做了几次预实验，都很失败，几乎没有点，用的是银染，现在想请教大家几个问题，
样品：脑脊液，
样本处理方法：4倍体积负20度丙酮沉淀过夜，2倍体积丙酮洗涤沉淀两次，每次2小时
上样量：400微克，上样总体积：400微升（因为定量出来的浓度为2微克/微升，所以用溶解在裂解液里的样品直接上样约200微升，加如200微升的上样缓冲液）ph胶条：4-7，
升压方式：
被动水化：16小时
S1:150伏特 2小时
S2:250伏特 2小时
S3：500伏特2小时
S4:1000 3小时
S5:8000 4小时
S6:8000 64000伏特小时
S7：500 14小时
二向：
SDS-PAGE在PROTEAN II XI Cel1电泳仪上进行。
电泳参数（T=14℃）：
5mA/gel 40min
10mA/gel 5h
1.一相电流大小有多关键，如果电流较大（超过50微安），但电压基本能升上去，这种情况下有必要换槽吗？
2，一相聚焦不理想会引起蛋白质丢失，从而染色出来没有几个点吗？
3，显色总是很慢，(约6分钟以后才开始现几个点）反应的是什么问题？
4，琼脂糖不凝固会影响一向到二向的转移吗？
5，二向压胶条的力度到底多大，太松太紧是否都不对？是不是最好等溴粉蓝跑出来以后再松去压胶条的针头等
附图如下，请指教


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2014-2-10 20:31
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发表于 2014-2-10 20:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 skytree 于 2014-2-10 20:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

做了几次预实验，都很失败，几乎没有点，用的是银染，现在想请教大家几个问题，
样品：脑脊液，
样本处理方法：4倍体积负20度丙酮沉淀过夜，2倍体积丙酮洗涤沉淀两次，每次2小时
上样量：400微克，上样总体积：400微升（因为定量出来的浓度为2微 ...

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是你所提供的材料让人很奇怪， 从你的IPG数据来看， 是典型的BIO-RAD的17cm的胶条所需要的参数， 而其后你所使用的2向却很奇怪， 居然是PROTEAN II xi CELL型的SDS-PAGE， 这个是用来做1D的。 而且你的参数就更奇怪了， 居然是5mA/gel 40min+10mA/gel 5h， 这样的话， 蛋白质都会扩散光的。
1. 如果是2D， 你一向17或者18cm的IPG胶条那么你2向用的BIO-RAD的只可能是PROTEAN II XL CELL 型（除非你只做一块胶， 不做比较）
2. 17CM的胶2向的电流一般是浓缩胶25mA， 分离胶50mA
祝实验顺利， 先解决好仪器和电流问题， 脑脊液本来就不好做， 我师妹也是2D高手， 她的图比你也只好一点点：）
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发表于 2014-2-10 20:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 bluelake 的帖子

不好意思，由于前辈的论文出错，资料上报有误：
实际情况是：
1，电泳仪的问题，把PROTEAN II XL CELL 写成PROTEAN II xi CELL应该是笔误，我用的二相电泳仪应该是你说的这个。即PROTEAN II XL CELL
2 二相的情况是：我每次二相是只跑一张胶，开始设置电流较小，电场力较小，方便蛋白质从一向转移到二相，待溴芬兰跑成一条直线以后再加大电流。正确的是
5mA/gel 40min
30mA/gel 5h，对了，插一句，你说的蛋白都扩散光了是什么意思？？？？
我们实验室其他人用的是10mA/gel 40min 30mA/gel 5h
拜托再帮我看看，顺便解决一下上次提出的5个问题，特别是显色，若是很慢就是没点，是什么原因呢？
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发表于 2014-2-10 20:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一."不好意思，由于前辈的论文出错，资料上报有误"
说得不客气点，自己的试验，居然连试验数据都不清楚，不出问题才怪
二.1.一向聚焦的时候，电流是有上限的，这个上限可以根据自己的样品情况而设置，一般是默认设置是50ul/gel。如果聚焦情况不理想，则可以适当的调整下最大电流上限。个人认为电流的大小跟槽没多大关系，主要因素还是样品中的离子含量。
2.一向时造成蛋白丢失的原因有很多种，eg:盐离子浓度过高；水化条件不当等等。根据楼主的试验参数，个人认把被动水化改成主动水化效果可能会要好些，因为主动水化有利于大分子进入胶条，当然这样会损失一部分小分子量的样品。
3.显色慢有可能是所用试剂的原因，特别是试验用水。（银染的原理至今说不清楚）
4.琼脂糖的目的是a.填补一向胶条与浓缩胶之间的间隙；b.固定一向胶条。琼脂糖不凝肯定会有影响
5.不太明白楼主的意思，也许是二向装置不一样，没有着方面的经验
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发表于 2014-2-10 20:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第5点的意思就是，上胶架前不是要用压舌板或者针头压教条吗，这个力度应该多大，据说太用力会导致二相胶的孔径变形，不压紧又会导致一向到二相转移不完全，就是这个程度掌握不好
另外，水化我可能没法采用主动，因为试验寻找的差异蛋白主要就是小分子蛋白。实验室用水的情况是采用二次蒸馏水，若是水的问题，其他人染色好像还没有出现过我这种显色很慢的情况。
另外，楼上批评的有道理，补充说明一下，试验时候参数是清楚的，是复制到此版上出了点差错。
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发表于 2014-2-10 20:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室在做一向转二向时工具比较简陋，压胶时就用两个塑料片（电话卡剪成的）
转移时轻轻把胶条压下去即可
操作：先在浓缩胶上灌入琼脂糖，然后将胶条轻轻压下，接着再加点琼脂糖封胶（即反灌法）
既然是小分子量的蛋白，为何不过下分子筛试试
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发表于 2014-2-10 20:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的意思是，先过分子筛，去除大分子蛋白，然后剩下的小分子蛋白再电泳，染色？这个没有试过，本来样品的蛋白质就很少了，其中免疫蛋白，白蛋白还占了百分之七十，剩下的如果再过滤，可能会全部损失掉了，这是个难题。
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发表于 2014-2-10 20:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果第一向电压达不到8000伏,第二向结果肯定不好,所以你要花精力把蛋白制备作好,第一向做好
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发表于 2014-2-10 20:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

聚焦的时候，各个电压段都应该是哪些分子在电泳呢？
比如说100V,250V,500,1000，蛋白质分子的移动一般发生在那个电压段。在这个电压段，电流应该是多少才正常呢，会不会是0呢？
还有，聚焦的时候是不是看得到修芬兰在移动呢？修芬兰的等电点在胶条的什么位置？
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雪花子[使用道具]
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发表于 2014-2-10 20:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得楼主的样本的问题主要还是在样本制备上， 脑脊液样本的目前国际上比较标准的制法其实是用的乙醇沉淀， 可以同时浓缩蛋白质和除去盐分， 避免它们对一向IEF的干扰。
以下方法来自Richard J.Simpson 《 Proteins and Proteomics: a laboratory manual》
参考文献不详。
材料： 腰部穿刺获得， 离心去掉细胞， 每份1ml,-80 度下储存
方法：
1. 室温下解冻脑脊液样样品， 漩涡混合
2. 1：9混合样本和乙醇 （脑脊液是生物危险品， 污染过的物品要用1M的NAOH清洗消毒）
3. -20度储存过夜
4. 5000g， 4度， 离心5MIN
5. 弃上清， 移走乙醇, 不要触及沉淀
6. 通风橱干燥10-20MIN， 但不能让沉淀彻底干燥
7. 加入裂解液（原始脑脊液体积为1ml 就加100ul)， 加2ul的 beta-巯基乙醇， 混匀， 室温放置30min
8. 超声处理30s
9. 5000 g ,4度， 离心5min
蛋白质的浓度会随着脑脊液的不同略有变化
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