小中大【求助】为什么western的结果总是没有目的条带？
请教高手：
我做组织中pSTAT3(分子量90KD)的western blotting总是没有目的条带（各组蛋白都没有条带），b-actin有条带。用同样的抗体做免疫组化有目的蛋白表达。简要操作过程如下：
1.蛋白是最近才提取的总蛋白，提蛋白的组织与免疫组化来自同一个组织。蛋白上样量是120ug；
2.分离胶浓度10%，浓缩胶4%。
3.转膜时间2小时，且考马斯亮兰复染胶，及立春红染膜，蛋白已转至膜上；
4.一抗，二抗都是snta的（分别是山羊抗大鼠和驴抗山羊）。并按该公司推荐的western的protocal进行封闭，抗体孵育（封闭液，孵育液中加的磷酸酶抑制剂是国产分装原钒酸钠），洗膜。一抗稀释1:200和1:1000，二抗稀释分别是1:2000和1:5000；
5.显色：碧云天的ECL。
另外，同实验室的同学做另一种磷酸化蛋白(50多KD)的western，除了一抗二抗不一样外，其它试剂都一样，而她的结果很好。
郁闷！请高手给支个招吧。
