【求助】翻译后修饰?

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标题:【求助】翻译后修饰?

红茶可乐[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在2DE中发现多个HSP27斑点，且位于同一分子量水平线上。我认为存在蛋白质的翻译后修饰现象。但在免疫印迹实验中并未应用特殊的方法提取蛋白（如磷酸化蛋白提取液）。出现了两条带,请帮助解释,谢谢!

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2014-2-12 16:47

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jkobn[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这种情况不一定是蛋白修饰，我们也做过相似的项目，它们应该是异构体，只有在后面纯化中把它分开了！

avi317[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

''但在免疫印迹实验中并未应用特殊的方法提取蛋白（如磷酸化蛋白提取液）''
有一点是可以肯定的,这不是磷酸化修饰,因为磷酸根的分子量太小了,不足以在SDS-PAGE上区分出来.
HSP27属于小分子Hsp家族,抗体主要针对其约100AA的C-端保守区域,你的胶如果跑得好,可以把这两个条带分得更开点.
有三种解释:
1.Hsp家族以外的蛋白,有着与HSP27C-端保守区域一样的AA序列,所以也被抗体识别了.我用GAPDH的单抗也出来两条带呢.小分子HspC-端保守区域与χ-晶体蛋白有很高的同源性.
2.两个热激基因编码的HSPs,都属于小分子Hsp家族,同源性较高,也有可能.大鼠Hspb1基因编码 23KD 的HSPB1和Hspb8基因编码 22kd的HSPB8,但这两个只有百分之四十几同源性.
3.异构体,如小鼠HSPB1两个isoforms,一个197AA,一个209AA.
我给你一篇文章,他的结果和你类似,也有两条带,
这只是个人意见,欢迎大家继续讨论.

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在楼上精彩分析之上，我也补充一下
1 不像是非特异性条带（由其他蛋白引起的，但二者分子量如此之近，而且张膜都很清晰，可能性不大）
2 觉得异构体的可能性大（平均一个氨基酸分子量100多一点，差几个就凑够了）
3 尚不能就此排除翻译后修饰现象。
楼主先说明一下抗体的性质（单抗？），查一下HSP27是否有磷酸化位点。如有，请说明磷酸化位点的个数、性质（丝氨酸/酪氨酸/苏氨酸），在何种情况下磷酸化并结合你的实验（如超过3个位点要考虑磷酸化修饰，一个磷酸化分子量增加80，不可能引起蛋白分子量明显改变，5个左右就有0.4k了，5个同时磷酸化在恰当分辨率的胶上亦可有所表现，不一定会被磷酸酶破坏）。否则可以排除磷酸化。

avi317[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

的分析很周全.真棒!
1.我觉得异构体的可能性最大,所以把它写在最后一点
2.不知道楼主做的是来源于什么物种什么组织什么细胞的HSP27?!
不同来源的HSP27蛋白可能磷酸化位点也不一样,我目前知道有三个位点,SER-15,78,82,这是我排除磷酸化修饰的原因.而且就就算有5个位点,0.4KD,那也够呛,在普通的SDS-PAGE上也是分不出来的,
3.看过其他文献上的HSP27,好多也有双带出现的,但是分的没这么近,我怀疑楼主跑胶是不是跑的不够开,但楼主说:''在2DE中发现多个HSP27斑点，且位于同一分子量水平线上。''
不知道楼主能不能把2D图传上来看一下.

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我只想说
极大可能是PTM
我也有类似的文章在投不过很不幸，有个审稿人（利益冲突投稿时没排除这人）鸡蛋里挑骨头 MD
虽然不知道具体的PTM方式（汤剂化磷酸化等）但一个蛋白质却容易发生PTM，具体表现在 2D胶上有很多个点（Mw一样 pI不同）均是一个蛋白质；
证明方式也很简单 2DE＋WB

eric930[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

继续补充
几个点都做过质谱的，全是HSP27，匹配率有多高？出现几个点，PI相差有各有多少？
也希望能看到2D图，或者用语言描述一下，以便分析原因。
另请提供抗体说明书或公司货号（尤其是单抗），以便明确表位存在的范围，如果是单抗，也大有助于分析。
2DE＋WB我倒是见过的，我待的实验室做过相关课题。有一个办法，就是选择已知的专门针对磷酸化位点的抗体去做2DE＋WB，可以确定有无磷酸化。或者专门用糖基化的抗体（我也见过，是楼下实验室做的，好像做糖基化抗体不是专门针对某个蛋白质的，而就是针对糖基的，所有蛋白的糖基都识别，没有深究过）。但还是不能鉴别到底是异构体还是磷酸化等修饰，如果这些磷酸化或者糖基化是几个异构体共有的话。
上次忽略了2D上出现等电点变化，只是从western上进行解释，尚不知异构体是否会导致PI变化，氨基酸确有酸性、碱性及中性氨基酸之分，酸性即一氨基二羧酸（如天冬氨酸、谷氨酸），碱性的即二氨基一羧酸（如赖氨酸）等。
在这方面不专业，确需遇到过类似问题的战友来解答，这是个通遇的典型问题，对实验的价值很大。回去要花些时间学习学习糖基化和磷酸化检测了。
顶一下，向知情战友求助异构体是否会导致PI变化，或者什么方法可以证明异构体?

红茶可乐[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PI 相差我不太清楚,只作了分子量的Marker,没作PI的Marker,但有一段距离
,
HSP27货号:美国Santa Cluz产品:sc1048,5个HSP27斑点,匹配率为47%/74%/49%/60%/47%

eric930[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先发个抗体说明书
链接 cuturl('http://www.scbt.com/datasheets_list/sc-1048.pdf')
SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.
HSP 27 (C-20): sc-1048
The heat shock proteins (HSPs) comprise a group of highly conserved, abundantly expressed proteins with diverse functions, including the assembly and sequestering of multiprotein complexes, transportation of nascent polypeptide chains across cellular membranes and regulation of protein folding. Heat shock proteins (also known as molecular chaperones) fall into six general families: HSP 90, HSP 70, HSP 60, the low molecular weight HSPs, the immunophilins and the HSP 110 family. The low molecular weight family includes HSP 10, HSP 20, HSP 27, HSP 32 and HSP 40. HSP 27 is a constitutively expressed cytoplasmic protein that co-localizes to the nucleus upon stress induced by insult. Heat, cytokines and hormones are among the factors that stimulate the synthesis of HSP 27. In vitro, HSP 27 becomes highly phosphorylated following exposure to stress. The discovery that HSP 27 is regulated by hormones such as estrogen has led to studies establishing a relationship between HSP 27 and breast cancer.
SOURCE
HSP 27 (C-20) is an affinity purified goat polyclonal antibody raised against
a peptide mapping at the C-terminus of HSP 27 of human origin.
说明：
1 HSP27组成性表达于胞浆，在损伤信号下入核；亦可被热刺激、细胞因子和激素诱导表达。在体外HSP27暴露于应激信号后高度磷酸化。在贴图中也可以看到刺激后HSP70表达增高并且分子量部分增加（因为不一定所有HSP70几个位点全同时磷酸化，所以条带是下端与未刺激齐平，上端上移，所以条带变宽，这点与1楼的western还是不完全相同的，原因也可能是1楼的图同时磷酸化的比例高，所以2条带截然分开？也不对，2D上有5个斑点呢，说明至少需5个磷酸化位点。）
2 本抗体为亲和纯化后多抗，表位为C端一段肽片段（一般多抗用来区分磷酸化和异构体就没有太大意义了，针对多个表位，不会因为1个磷酸化位点的破坏而失去识别抗原功能。目前已知3个丝氨酸位点,SER-15,78,82,，氨基酸是从C端开始标位的吗？谁来告诉我？要是表位也落在这个区域，又很难讲了）
磷酸化有些眉目，慢慢来，再查查磷酸化位点，以及异构体情况。
这个帖子发了我整整1个小时，发完了才看到搭档也发了帖子。好，dxy要的就是这个氛围。讨论版嘛，百家争鸣，大家都不要胆怯，只要讨论的好，版主理所当然会给加分，何必计较得道与否。这样才有讨论的气氛嘛。都不要后退，大家都畅所欲言，把自己的观点直接提出来，无论是否专业，是否成熟，知识只有更新才有活力，思维是第一位的。
匹配率最小的也接近50％，看来这5个都是HSP27了。另楼主把1楼4个泳道对应的处理因素也说一下，看能否从图中找到点线索，了解你的实验设计，也利于分析结果。
我已在本版色谱老前辈的蛋白纯化置顶帖里把这个情况向老前辈说明了，不知他老对此有无看法，大家静候。
众人拾柴火焰高，大家齐心协力，都来帮帮忙

附件

2014-2-12 16:52

23322592.snap.jpg (27.67 KB)

12xunmei[使用道具]
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发表于 2014-2-12 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我对isoform的理解：
1 来自两个以上的同源基因，比如A1 A2 A3三个同源基因，分别对应有A1 A2 A3三个蛋白质，而这三个蛋白质均不存在任何的PTM，也可称为isofrom
2 只有一个基因，对应的蛋白质却存在几种形式，典型的isoform，
来源于蛋白的PTM，如果采用2DE+WB鉴定，则很容易鉴定到整个2DE胶上，存在几个Mw一样而pI不同的几个点，因为一发生PTM，则容易导致该蛋白的pI发生变化；
当然，如果钱够多，现在用MS技术完全可以鉴定出各个isoform发生了什么具体的PTM；理论上，各个isoform肯定有其生物学意义，不过实际上你不知道它具体的生物学意义，你没必要鉴定它吧，虽然先鉴定它可以帮助理解其生物学意义；
只要有抗体，没事作作2DE＋WB 我相信很大部分单基因编码的蛋白均存在类似现象
我的文章很简单，就是用2DE＋WB发现了一个蛋白质具有几个isoform形式，
其中一个为乙酰化且表达量最大；而且在不同的材料中发现了isoform 的
pI漂移，后发现是一个酸性氨基酸突变为碱性氨基酸
MMD 有个审稿人就是不想让我发表

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