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标题:【求助】无荧光

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-2-12 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】无荧光

电泳可见marker跑的正常，转膜后立春红染可见蛋白条带，5%TBST牛奶封闭一小时，4度一抗孵育过夜，TBST洗三次，每次十分钟，二抗孵育两小时，TBST洗三次，每次十分钟，pierceECL显色，曝光，肉眼无荧光，无条带，老大帮忙分析下，谢谢
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ffooll[使用道具]
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发表于 2014-2-12 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，loading buffer会不会对蛋白有影响，七月份同样条件可见明显肉眼荧光，loading buffer 配置后-20度能保存多长时间，DTT没现加会不会有影响啊 郁闷！
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-2-12 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

ECL显色，不要相信你的眼睛，肉眼下有无荧光实在不能作为WB成功与否的标准。“五条带”什么意思？请确定你的抗体有无问题。
loadingbuffer保存在-20几乎是没有问题的。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-12 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
五条带

============================================================

没有条带吧？
首先考虑样品问题。是否加蛋白酶抑止剂了？样品在4度放置多少时间了？
loading buffer放-20度应该不会有问题。
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am10[使用道具]
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发表于 2014-2-12 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我和楼主有同样的问题，同样的条件8月份做的很好，但是从9月底之后就比较郁闷了，ECL显色肉眼无荧光，压片之后显影片上也无任何条带。
转膜后染色膜上是可见清晰的条带的。
请各位高手指教一下
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发表于 2014-2-12 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"DTT没现加"?没加DTT或起相同作用的β-巯基乙醇，肯定会有影响！
我有过相同的经历，相同的蛋白提取方式，一样的抗体及稀释比例，天变凉了，就出不来了！后来发现是抗体孵育的过程，出了问题～
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发表于 2014-2-12 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DTT没现加的意思是buffer是配好的，有种说法是DTT最好是在煮蛋白的时候现加，我不是，会不会有影响啊 PMSF是六月份配的，-20度保存，会有影响吗 样品九月份提的，保存在-80度
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发表于 2014-2-12 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DTT没现加应该影响不大，PMSF的遇水很快失效，所以要临时加，其本身不会那么容易就失效吧!
看样品保存有没问题，可先做个内参，整个体系没问题的话，可能就是所检测的目的蛋白已经降解了~
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ffooll[使用道具]
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发表于 2014-2-12 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近内参只做出来一次 这几次内参也出不来了
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发表于 2014-2-12 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那就要参照上一次内参出来的条件了，检查整个体系，看有什么变更？
个人觉得最大的可能原因：一 蛋白的问题，
二 抗体的孵育过程，或者抗体本身的问题～
解决方法：不变更实验试剂的情况下，重新提蛋白试试体系，保证抗体的充分孵育，可优先孵内参！
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