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标题:【求助】心脏蛋白双向电泳图上横纹很多

vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-2-12 19:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】心脏蛋白双向电泳图上横纹很多


各位高手。我基本排除了下，是三个原因，好像应该是
1。蛋白提取的问题
2.聚焦时间的问题
3.ddt用量的问题
在提取心脏蛋白的过程中用的裂解液为
7m尿素，2m硫脲，4%chaps， 20mMddt，1mM pmsf
先去心脏组织剪碎，转入匀浆器中，加裂解液，冰浴匀浆，4°c放置30min，反复冻融3次，16000g离心30min取上清50ul 分装。
这里有2个问题。一 组织匀浆中出现很多泡沫，到最后裂解液都很少了。
二 有剩余的话提出的蛋白颜色很黄，不知为什么
以上的蛋白提取方法不知到会不会影响到最后胶图中出现大量横纹。
聚焦时间是6步
s1 250v slow 1h
s2 500v slow 1h
s3 1000v slow 1h
s4 10000v 线性 5h
s5 10000v rapid 60000vh
s6 500v rapid 20h
前三步为除盐 最后总伏时为89000vh,用的是17cm 3-10的胶条，再水化为18h
不知到这种聚焦完全不？在资料里看到要超过100000vh容易聚焦过度，也会导致横纹的出现》》》
望高手给予指点


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2014-2-12 19:58
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发表于 2014-2-12 19:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
S4 2.5小时就可以了
看你的图像是聚焦过度了，可以试试8000V
S1~3都应该是快速
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发表于 2014-2-12 19:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上样量有点大
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-2-12 20:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这边实验室的s1-s3是除盐的步骤，他们是走slow的
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-2-12 20:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有没可能是蛋白有杂质的原因？那个离心速度不高。
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发表于 2014-2-12 20:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LZ是银染，还是考染？不知道上样量是多少？
出去横条纹后，点分得还蛮开的，可是看上去并不算多的样子~
匀浆时出现的泡沫是蛋白减少的原因之一，尽量避免吧~
另外，呵呵，心脏组织中的血很可能是导致蛋白提取液发黄的原因哈！
如果聚焦没有问题，那么可不可以多加点DTT？我记得有些文献会用到65Mm的DTT~试试看吧~
GOOD LUCK~
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发表于 2014-2-12 20:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外匀浆引起泡沫会降低蛋白的含量，俺是听师兄说的，这个可能是他的经验之谈，或者他在哪里看到过吧~
但是原理我还不是很确定（蛋白会降解的原因），请高手解释吧~
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-2-12 20:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量为150微克，银染
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luoliqiong[使用道具]
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发表于 2014-2-12 20:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LZ左边应该是碱性端右边酸性端吧！
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kswl870[使用道具]
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发表于 2014-2-12 20:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

homogenizer usually cause protein degradation by heat (which can be avoid by ice bath) and shear stress, try smaller size of homogenizer tip or lower speed.
you gel looks overfocused.
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