【求助】显色蛋白条带大于目标蛋白分子量，何故？

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标题:【求助】显色蛋白条带大于目标蛋白分子量，何故？

KGZ564[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位好，感谢你的阅读，如你能提供你的宝贵建议，将感激不尽！
我的目标蛋白45kd，常规跑胶，转膜，抗体孵育，ECL发光，发现在65kd处，有规则条带出现，而45kd处，无明显的条带。考虑可能是蛋白还原不好，又加了巯基乙醇，加大了SDS的量，结果未变。问题：1、65ka处的条带不应该是目的条带吧？2、如何改进，使目的条带出现呢？

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你的目标蛋白是真核生物分泌表达的话，可能是有糖基化修饰。
65ka的带是不是目标蛋白，关键要看对照。

KGZ564[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢你的支持，我做的是睾丸组织中该蛋白的表达，该蛋白名为scf，也叫c-kit配体，是一种分泌蛋白，但在睾丸种主要以膜结合型为主，抗体说明书上的分子重量为45kd，适用于小鼠、大鼠和人，但没有说明各组织的情况。做了好几遍了，都在65kd出现强条带，我个人倾向于认为该强条带不是我的目标条带。
你所言之糖基化，我了解不多，会造成这么大的差距吗？
此外，对照如何做呢？请明示。
再次表示感谢，作western blot 时间不长，真的希望能得到高手的指点。

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

简单点说就是蛋白可能被修饰了。
一般的说上样loading会影响蛋白的位置，比如6乘的你loading你按5乘的来加，最后蛋白的位置就会差一点，或者说在煮沸过程中有水汽渗入，但都不足以影响45kd到65kd。
个人赞同1楼的意见。你去查下文献里，别人在杂这个蛋白的时候，分子量是多少。如果有文献报道也是65kd，你就可以放心了。
如果你做过抗体，或者纯化过蛋白，你就会知道，有的蛋白酵母表达系统比大肠杆菌表达系统表达出来的蛋白大个20kd是常有的事：）
加油！

KGZ564[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

虽然问题还没有解决,但是感到不是一个人在处理这个问题，比较有动力。
我做的蛋白目前还没有查到在睾丸组织中表达的文献,比较新的文献多在做mRAN水平的表达。可能是我查文献不得法，真的还没有发现，故而比较郁闷。
今天换了个蛋白，GDNF，说明书上的分子重量为15KD，而我发光发现，条带在34-44KD之间。如图

附件

2014-2-13 15:09

49632010.jpg (67.4 KB)

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不光是糖基化，磷酸化也会导致蛋白在SDSPAGE上的迁移与预期不符，一般来说，如果蛋白上带的负电荷比较多，那么其迁移可能会比实际大小要慢，最有名的例子就是大名鼎鼎的p53

eve_49[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好!
1.45--65KDa;15--34~44KDa,相差都在20~30KDa之间，你的GNDF如果是商品化的蛋白，那么有可能是你的蛋白质Marker有问题，建议换蛋白Marker,同时在跑SDS-PAGE时添加BSA等有明确分子量的蛋白作为分子量对照，这样可以看出是不是你的Marker本身有没有问题？(其实蛋白Marker只能做相对的分子定量)
2.你的45KDa的目的蛋白是自己重组表达的还是根据基因序列预测的？如果是重组表达的，而且抗体是你自己用重组蛋白做的；那么你在诱导表达时应该会比较清楚差异条带（目的条带）的位置，那么用重组蛋白做的WB的结果和普通的SDS-PAGE胶一对比你就可以知道是否为目的条带，同时也可以检验你的抗体是否有很好的特异性；如果你用天然状态的蛋白来做WB的话，鉴定是否为目的条带的最好方法就是直接切胶或者剪膜做质谱鉴定。蛋白质鉴定最直接的证据个人觉得直接质谱测序会比较好，方便快捷。
我个人的一些观点，希望能对你有所帮助
祝：实验顺利！

KGZ564[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我会根据各位的指点进行进一步的实验。我的两个抗体都是商业化的，实验设计也相当简单，就是想看看这两个蛋白在大鼠睾丸组织中的表达。没想到会遇到这样的问题。marker 换了，也上过BSA，都没有问题。
明天还要做一次，到时再看结果。

am10[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两种蛋白都出现偏大的情况，也许不是蛋白本身的问题，检查一下实验步骤，电泳前沸煮时间是否足够，变性不彻底，蛋白上还连着其他配基，也有可能出现这种结果。
另外查下文献，既然已经商业化，做的人因该不少，看看别人做的都多大。