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标题:【求助】做HIF-1a,甲状腺肿瘤，跑胶竟然出现棒槌形的？

dog002[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做HIF-1a,甲状腺肿瘤，跑胶竟然出现棒槌形的？


近日做western 跑甲状腺的正常组织和肿瘤组织，正常组织出现很奇怪的形状，而且大分子量的都没有！
提蛋白的时候都是同一批提的，蛋白裂解液，然后超声4-6次，4°离心取上清；SDS-PAGE,4%的浓缩胶80v 30min，10%.7.5%的分离胶都用过大约60min；
这张图是为了摸索上样量，四个一组，第1.5.9是正常组织，其它是肿瘤组织。
第一次出现这种情况的时候怕是问题出在提蛋白上了，就又重新提了一次正常的和肿瘤的组织，可是跑电泳仍然这种现象！
高手们帮忙看看，为什么会出现这种情况呢？感觉很是奇怪，望各位能给点指导！谢谢！


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2014-2-13 15:27
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发表于 2014-2-13 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨日查了一些文献，是不是hif-1a在操作过程中降解了？ 请问什么情况下会降解呢？ 在手术取材和保存的过程中，还有提蛋白的过程中都得怎么注意些啊！
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glass[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

hif-1a在提取后是很容易降解的，在提的过程中一定要动作快一点，效果可能会好一点。
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 glass 于 2014-2-13 15:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

hif-1a在提取后是很容易降解的，在提的过程中一定要动作快一点，效果可能会好一点。


肿瘤组织经过冻存后不是就不会再降解了吗？细胞都已经死了啊？
提取液里加了pmsf了
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-2-13 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样前的离心时间不知道您现在用的是多长时间，可以稍延长点。
另外上样量需要控制，提取总蛋白后，最好能做一个总蛋白量的测定，再上样。可能会情况的解决有好处。
一点参考意见，祝顺利！
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发表于 2014-2-13 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 avi317 于 2014-2-13 15:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

上样前的离心时间不知道您现在用的是多长时间，可以稍延长点。
另外上样量需要控制，提取总蛋白后，最好能做一个总蛋白量的测定，再上样。可能会情况的解决有好处。
一点参考意见，祝顺利！ ...

您说的“上样前的离心时间”，是指在加入了溴芬兰、sample buffer和样品，沸水煮5min之后的离心吗？ 我们的操作流程上没有写过时间，我都是大约离心10秒吧，请问应该多少时间呢？ 是因为离心时间不够然后上样，导致这个问题呢？ 不太理解，请指教！
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发表于 2014-2-13 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 dog002 于 2014-2-13 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


您说的“上样前的离心时间”，是指在加入了溴芬兰、sample buffer和样品，沸水煮5min之后的离心吗？ 我们的操作流程上没有写过时间，我都是大约离心10秒吧，请问应该多少时间呢？ 是因为离心时间不够然后上样，导致这个问题呢？ 不 ...

煮的时间基本上可以达到要求，不过还是建议十分钟。
离心时间10s太短了，至少延长至10min。
因为您是裂解细胞后上样，大量的细胞碎片和大分子的蛋白随着破壁而释放至溶液中，如不同长时间的离心，就上样的话，很容易造成如您现在所遇到的情况。堵塞泳道，导致条带变形等的情况。
另外上样量还应该优化一下，如嫌定量麻烦的话，就自己按照目前的上样量做一个梯度稀释吧，例如 1：5 、1：20 、1：50 、1：100，看看结果如何。
祝顺利。并期待您上传新的试验结果。
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 小中大

相关疾病：
肿瘤
感谢avi317的耐心讲解，不过有一点好像您没有留意，我做得不是细胞，是手术取材的肿瘤和正常组织啊！ 这样处理情况是不是就不一样了吧？
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avi317[使用道具]
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 小中大


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原帖由 dog002 于 2014-2-13 15:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
肿瘤
感谢avi317的耐心讲解，不过有一点好像您没有留意，我做得不是细胞，是手术取材的肿瘤和正常组织啊！ 这样处理情况是不是就不一样了吧？ ...

组织不也是由细胞组成的???
呵呵
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dog002[使用道具]
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 小中大


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原帖由 avi317 于 2014-2-13 15:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')



组织不也是由细胞组成的???
呵呵

好的，回头改进下实验方法！
不过为什么总是正常组出现这种情况呢？而且是屡做屡出！别的组都没有啊。
再请问下jnuxz，哪里有甲状腺的全蛋白电泳图吗？ 我很想比对一下，看看我跑的条带跟人家的一样吗，因为总是看不到明显的大分子，所以不清楚是本身组织就没有这个蛋白，还是因为实验手法的问题。
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