蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】超声裂解上清隔夜析出蛋白

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】超声裂解上清隔夜析出蛋白

cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
1

发表于 2014-2-13 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】超声裂解上清隔夜析出蛋白


急问!
我用BL21菌表达his-tag蛋白，14kDa
第一天，超声裂解后离心，12000rpm 4度 20min，跑胶发现蛋白在上清中有一半多(做过三次表达的重复)，决定上清直接过Ni柱
上清放4度冰箱过夜，第二天，发现析出很多沉淀。再离心，跑胶，发现上清与沉淀中均有目的蛋白，此时上清虽然不像纯LB那样清亮，但也清澈透明
第三天，取出上清，又发现变混浊，析出好多沉淀。
我用的超声裂解buffer是
Tris HCl 20mM
NaCl 50mM
EDTA 1mM
Urea 1M
TritonX100 0.5%
PH8.0
2L的菌用60ml buffer裂解
请问：
1、为什么总是析出沉淀？
2、可不可以趁离完心，上清透明时透析，然后过Ni柱
3、沉淀可不可以再超声洗涤，用包涵体变复性的方法纯化得到目的蛋白？
谢谢!
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
2

发表于 2014-2-13 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
根据我做的试验，在蛋白比较杂的情况下低温一般都会有蛋白析出的，高压均质离心上清大多也会出现这种情况，另外既然你打算上Ni柱，为什么裂解液里面加入EDTA呢！我觉得你的裂解液里面EDTA，Urea都是多余的，另外NaCl的浓度不够，打算过NI，有一定的非特异吸附，建议NaCl浓度500mM！2L菌用60ml裂解buffer，我觉得既然你的菌不是离心后的实体，而且菌液体积远大于裂解液，各种试剂浓度应该考虑终浓度，而不单是裂解液浓度！毕竟是要过NI柱的~~沉淀我个人认为没必要再超声了，我以前也试过的，你可以把沉淀以缓冲液稀释溶解，缓冲液里面加点tritonx100
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
3

发表于 2014-2-13 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢!
我是打算裂完上清先透析再上柱的
因为表达的菌吸1ml出来小量超声，目的蛋白主要是在沉淀里
而一换成大量超声，蛋白就跑到上清里了(不知道是什么原因)
怀疑是不是超声buffer里有Urea的缘故，超声时间长了就跑到上清里
因为蛋白在上清里可以避免变复性，所以还是选择了加Urea，然后再透析的方法
再请问
沉淀里主要是什么呢？蛋白+盐？
用缓冲液稀释溶解怎么做？上柱buffer 4度搅拌过夜？溶解后就可以直接上柱了吗？会不会还含有EDTA和Urea？
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
4

发表于 2014-2-13 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

晕，你的融合蛋白是可溶还是包涵体的？怎么一会又是沉淀，一会又在上清里面？感觉1M的尿素溶解可能性比较低，但也有可能。
沉淀你可以先跑个电泳看看有没有你的融合蛋白先！缓冲液稀释蛋白目的在于还有没必要再超声，沉淀里面肯定也有EDTA的，过ni肯定是有影响的！
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
5

发表于 2014-2-13 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个蛋白以前实验室有人表达过，是在包涵体里
所以我开始就当在包涵体里做的，还把上清倒了，结果两次跑胶都发现蛋白有一半在上清里
于是第三次表达打算上清透析后过柱的
简单说就是
表达后超声破菌，跑胶，上清和沉淀里都有目的蛋白
发现破菌上清隔夜析出蛋白后，离心并跑胶，上清和沉淀中都有目的蛋白
隔夜离心后的沉淀，可不可以这样处理：
buffer配方
tris hcl 50mM
NaCl 500mM
tritonX100 0.5%
加此buffer 10-20ml 4度搅拌过夜溶解
然后用
tris hcl 50mM
NaCl 500mM
透析，上柱
还是说，多加点buffer溶解沉淀，忽略EDTA和Urea，不用透析直接上柱？
谢谢!
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
6

发表于 2014-2-13 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得像是部分可溶表达，部分包涵体，裂解液里面先不加尿素超声，然后离心看上清和沉淀里面是不是都有目的蛋白！
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
7

发表于 2014-2-13 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

表达后取菌液不超声，直接离心？
那上清不是分泌到胞外的蛋白吗？
其实我只是想知道析出的蛋白怎么处理，因为看上去蛮多的，而且确定有目的蛋白在里面
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
8

发表于 2014-2-13 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 cbou876 于 2014-2-13 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

表达后取菌液不超声，直接离心？
那上清不是分泌到胞外的蛋白吗？
其实我只是想知道析出的蛋白怎么处理，因为看上去蛮多的，而且确定有目的蛋白在里面 ...

刚才想错了，是不加尿素超声后离心，不知道是不是那尿素的原因导致部分包涵体溶解！我觉得先确定是否是猜测的这种情况比较好，后面就好做些！而且这种原因比较复杂的蛋白析出可控性不好，能避免尽量避免！
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
9

发表于 2014-2-13 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是裂解液力的尿素使得包涵体部分溶解了？导致裂解的上清有目的蛋白？
顶部