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标题:【求助】请教western blot膜再生strip的原理

bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-2-13 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教western blot膜再生strip的原理


想请教一下大家，strip液作用的原理是什么？是否能将一张膜再生后做同一种抗体的western blot呢？刚开始做WB，请大家多多帮忙。谢谢！
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tie8[使用道具]
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发表于 2014-2-13 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

使用stripping buffer 可以去除一抗和二抗，然后可以重新利用膜。
我用stripping buffer之后还是做同一种抗体，
只不过根据ECL效果调整抗体浓度。
和重新跑胶、转膜相比，呵呵，能节省点时间。
由于重复使用，蛋白信号会有一定减弱，所以我一般用三次，感觉还可以。
网上很多配方，可以自己配的。
祝一切顺利！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-2-13 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这里有配方，但是STRIP以后，发现效果不是很好，所以，我干脆多转几次算了
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tie8[使用道具]
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发表于 2014-2-13 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想请教一下大家，strip液作用的原理是什么？是否能将一张膜再生后做同一种抗体的western blot呢？刚开始做WB，请大家多多帮忙。谢谢！

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1。stripping buffer 含有适量的sds，在低ph值或适当的温度下，可以使膜上的大多数抗原抗体复合物分开。
2。完全可以用同一种抗体再杂交一次。
我的经验是同一张膜stipping3次就差不多了，而且用同一种一抗，信号强度是一次比一次递减的。
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douding66[使用道具]
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发表于 2014-2-13 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

strip的配方有多种，不同的配方，strip的原理都不太相同。但是目的都只有一个，那就是使膜上的抗原抗体复合物分开。
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standbyme[使用道具]
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发表于 2014-2-13 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1M Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。
方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。
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发表于 2014-2-13 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么非要stripping呢，如果你的检测蛋白不在同一个分子量范围内,把膜直接用与另外一个抗体的检测就可以了，没必要做stripping了.
另外,stripping一般都不完全,含SDS的强stripping配方容易造成膜上蛋白丢失,一般推荐使用中度强度的低pH Glycine,可加热的配方.
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发表于 2014-2-13 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么非要stripping呢，如果你的检测蛋白不在同一个分子量范围内,把膜直接用与另外一个抗体的检测就可以了，没必要做stripping了.
请问zebrafishtom：
直接用是什么意思？用蒸馏水把ECL洗掉，然后直接与另一种一抗孵育？
或者 与一种抗体孵育后，再与另一种抗体孵育，最后一起显色？
我正在考虑运作方式：对于几种单克隆一抗，其抗原蛋白的分子量不同，能否一一孵育，最后一起ECL显色，检测？有人尝试过吗？
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-2-13 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你的蛋白分子量相差较大，可以直接用TBST洗膜，3次*10min，然后就封闭，孵育一抗和二抗，后面的步骤都一样的，效果不错，我们做过。
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发表于 2014-2-13 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么非要stripping呢，如果你的检测蛋白不在同一个分子量范围内,把膜直接用与另外一个抗体的检测就可以了，没必要做stripping了.
请问zebrafishtom：
直接用是什么意思？用蒸馏水把ECL洗掉，然后直接与另一种一抗孵育？
或者 与一种抗体孵育后，再与另一种抗体孵育，最后一起显色？
我正在考虑运作方式：对于几种单克隆一抗，其抗原蛋白的分子量不同，能否一一孵育，最后一起ECL显色，检测？有人尝试过吗？

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呵呵,楼上的意思是如果抗原分子量不同,可以根据预染MARKER分别剪开,分别孵育,(虽然预染MARKER不太准,但是基本差不多,可以多剪一些),最后ECL显色，检测
GOOD LUCK
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