【求助】重组表达的蛋白没有活性！

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标题:【求助】重组表达的蛋白没有活性！

seven7[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的蛋白在pET32a表达体系中重组表达，蛋白带His标签，细菌裂解液和沉淀中均有表达，我只是选择了可溶性的部分，过镍柱纯化，得到的融合蛋白比较纯，但是有部分二聚体形成（根据电泳结果中的分子量，差不多是）。现在我用肠激酶酶切后直接检测蛋白的活性，几乎没有，正是郁闷。现在找原因，想请问各位高手：
1. 蛋白失去活性，是因为什么？刚刚看到有人说还原剂会影响蛋白的二硫键，我在镍柱纯化时洗脱蛋白的洗脱液中含有2-巯基乙醇，而我的蛋白正常构建中含有二硫键，是因为这个原因而使活性丧失吗？还有洗脱液中的咪唑也有影响吗？
2. 蛋白在N端带有的His标签也会影响他的活性吧！酶切之后没有先去除它就测活性会不会影响？
3. 各位应该有用过肠激酶吧！酶切之后跑电泳有酶的这条带吗？我的就没有。有时候酶切之后只有目的蛋白+His标签也就是融合蛋白和His标签，目的蛋白却没有了！为什么呢？我购买的是国产的肠激酶，不知道影响大不大？还是我酶切的条件不对的原因呢？
帮我分析一下原因吧！谢谢了

2541[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、不是说你的蛋白失去了活性，而是很可能你的蛋白表达出来之后就没有活性。
既然你的蛋白本来就含有二硫键，那么不需要在提纯的时候加2-巯基乙醇。
你的二硫键是分子内的，还是分子间的？
2，his标签因为位于蛋白的末端，几乎对结构没有影响，所以几乎不会对功能造成影响，这也是his标签如此通用的一个重要原因。
3，酶切之后电泳上是看不到肠激酶的，因为量太少了。
其实最主要的原因，是你的蛋白虽然可溶了，但是确未必形成了正确的构象，如果蛋白没有正确的结构，当然就不会有活性的，建议你作个cd，看看是不是有二级结构，更准确是NMR一维谱。
另外你可以作个对照，就是一个是单纯的gst＋his，另一个是你的蛋白＋gst＋his，分别测酶活，如果对照没有活性，那么其实你如果想要检测你的酶活，就没有必要做酶切这一步，直接带着tag测酶活也一样的，这样就排除你所担心的2、3。

seven7[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 我的蛋白的二硫键是分子间的，不需要加2-巯基乙醇吗？我是看镍柱的说明书上的binding buffer和洗脱液中都要加它的。不加的话。不是比较容易形成二聚体吗？
2. 你的意思蛋白没有折叠成正常的空间结构，那cd是什么？具体怎么做呢？
3. 如果真的是我的蛋白表达出来就没有活性的话，那怎样才能让它折叠成正常的空间构想呢？
4. 我的最终目的不是仅仅为了测他有没有活性，而是想得到有活性的纯的蛋白，所以酶切是不是也是必要的？
再次感谢

BUK[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不晓得你用的是哪家公司的镍柱，我用的是novagen的，说明书上没有说明需要巯基乙醇
CD是圆二色谱，可以检测蛋白的二级结构，你可以送样到生物公司去做，如果你们单位有的话更好一些。
想要折叠成为正常构象，可以尝试一下蛋白质复性，或者更换一下载体和表达宿主，或者优化一下表达条件试试看
不知道你得到纯蛋白用于什么目的，如果是对其结构进行检测的话就需要酶切，如果只是对它的性质等等进行研究，则不需要

gogo[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的目的蛋白分子量多大啊?是不是很小?
你有阳性对照吗?

ha111[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 seven7 于 2014-2-15 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的蛋白在pET32a表达体系中重组表达，蛋白带His标签，细菌裂解液和沉淀中均有表达，我只是选择了可溶性的部分，过镍柱纯化，得到的融合蛋白比较纯，但是有部分二聚体形成（根据电泳结果中的分子量，差不多是）。现在我用肠激酶酶切后 ...

1：Ni柱可以耐受低浓度的巯基乙醇，但在Ni柱纯化时很少加这种还原剂，因为这种还原剂有时候会还原Ni柱上的二价Ni，你跑的电泳是SDS-PAGE么？如果是，SDS-PAGE看的是蛋白亚基分子量，这分子间的二硫键已打开。
2：折叠成正确的空间构象很难确定，通常在细菌周质表达的蛋白折叠正确构象的可能性会高些，另外有TrxB和gor突变的细菌也有利于蛋白折叠，Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB， Origami，Origami B和Rosetta-gami™
3：如果你需要完整的有活性的蛋白，首先要考虑蛋白在原核表达是否适合，有没有后加工修饰，国外有没有这种先例，其次你要考虑活性检测方法是否灵敏
4：你也可以考虑单独表达完整蛋白来看看是否有活性，这样消除了融合蛋白的影响，同时也可以降低成本，多试试几个载体，对你有好处

seven7[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 我的目的蛋白分子量是5-6kd，分子内形成3个二硫键，三对二硫键是通过Cysl Cys5，Cys2 Cys4和Cys3 Cys6之间连接成的三条反平行的Beta片层三级结构，蛋白带正电荷，理论PI为10.3。它的活性检测方法应该是很灵敏的，而且我也有做阳性和阴性对照。
2. 镍柱我买的是inventrige的，是填料，我自己装的柱子，说明上的buffer，甚至细菌裂解液中也有，浓度倒是不高。如果不能用巯基乙醇的话。需要用什么还原剂呢？
3. 目前这种蛋白的重组表达主要是用原核表达体系，也有不少人做出了有活性的蛋白。所以我怀疑一定是我的某一步出现了问题。riboenzyme，你的意思是换一种有益于蛋白折叠的表达细菌吗？蛋白复性可以解决吗？怎么做呢？透析复性？效果好吗？还有一些什么办法呢？如果复性还是不行的话，我就只好考虑换载体和表达宿主了，可是那也太麻烦了吧！天哪！！

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发表于 2014-2-15 10:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了一天的帖子，这样考虑了一下，各位帮忙看一下，是否可以？
1. 作蛋白的复性，应该是把洗脱液中的还原剂巯基乙醇去掉，会不会好一些？请教一下，怎么去除巯基乙醇呢？用脱盐柱可以吗？还是做透析复性呢？
2. 改变优化诱导条件，能否使蛋白活性表达？没有纯化前直接表达出来的蛋白能否直接测活性呢？最好是有个对照吧！
再帮我分析一下，谢谢各位了

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小中大

1、蛋白复性当然是可以的，但是你的蛋白带有太多的cys，复兴起来要复杂的多，不过你可以试试，你可以参考这个网站上详细的protocol
cuturl('http://refold.med.monash.edu.au/')
但是坦白的说，很不容易的。
2、这个也是我建议的。
建议你用pmal，可以尝试一下，这是目前我认为在促进蛋白折叠方面最好的载体了吧。
3、你的蛋白肯定是真核细胞中的对不？
那么你其实可以考虑在酵母中表达，应该就不会存在折叠方面的问题了

箭头儿[使用道具]
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发表于 2014-2-15 10:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

复性需要技巧、经验和耐心，初学者做起来有点复杂。你的蛋白只有5-6K，是很小的，而pET32的融合蛋白Trx大概有20-30K，你中间没有长Linker，Trx完全能否包裹或阻碍目的蛋白的空间，没有活性很有可能，如果你是准备融合蛋白复性就不必要了。重新构建载体和复性比起来，构建载体是最简单的。建议如下：
1：采用pET22载体，有信号肽，结合Origami细菌，带有His Tag或不带有，在细胞周质表达
2：真核表达，筛选有点痛苦
3：5-6K，你的蛋白也就40个氨基酸左右，如果你的目的不是大量表达，而是要做这个蛋白的后续功能，建议任何合成蛋白，速度快，纯度高，价格也还可以
路漫漫，兄弟要有思想准备，小肽比较难做

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