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标题:【求助】暗室中可以看到膜上有条带，但是曝光。。。

any333[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】暗室中可以看到膜上有条带，但是曝光。。。


做了几次western blot,每次都碰到不同的问题，这次又碰到一个问题，还请高人指点：我在暗室里用ecl作用于膜之后，可以看见弱弱的荧光，但是曝光时却什么都没有，空白一片。。。而且还碰到一个问题，就是没有变性的蛋白actin没有条带而目的蛋白却出现了条带，实在是想不出什么原因，望哪位高人出来指点迷津，拜托了。。。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是膜被污染了
暗室中看到是弱弱的白光
所以曝光的时候就没东西
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bring[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议：
1
荧光弱的时候建议增加压片时间，可在10min以上；
2
在显影液中适当增加显影时间，直到有条带出现，注意显影液及时更换；
3
你是内参做不出来还是什么问题？为什么不变性？
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

更换新的显影液和定影液
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能原因是由于抗原浓度过高，使ECL消耗
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bring[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的，
抗原浓度过高关ECL啥事儿啊？它又不消耗ECL。消耗ECL的是二抗上的辣根过氧化物酶
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发表于 2014-2-15 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的建议。我的目的蛋白变性的话完全没有条带，但是不变性还可以出现，所以只能选择不变性的做。显影时间一般是多长时间啊？？？是不是一直等到条带出来？？？
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any333[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
显影时间最大限度是多少啊？那个ecl一般要用多少啊？
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bring[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
显影时间最大限度是多少啊？那个ecl一般要用多少啊？

========================

足够覆盖住你的条带就行了
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-2-15 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近做WB比较多，我也来说说我的看法：
1.最可能的是你的显影液已经失效，显影液配了以后即使是避光保存在一段时间后也还是很容易失效，暗室里能看见荧光，可有时显影出来却是空的，胶片完全透明，我用了两个牌子的显影液都出现这样的情况。而新配的显影液却效果很好，短短几秒钟就可看见条带出来了，即使是暗室里肉眼看不见荧光的在显影很短的时间后，也可以看见条带或是泳道的背景。至于定影液似乎就关系不那么大，只要避光保存，可以用很长时间都不会失效。
2.会不会是你的胶片质量不好？
3.也有可能是你的ECL发光持续时间短，在你加了ECL之后到胶片曝光这过程你用的时间多，可以把你同学的ECL借来用用排除一下
4.延长胶片曝光时间，可以曝光一两个小时，我们实验室的老师说他们曾经还让胶片曝光过夜的
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