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标题:【求助】JBC的一篇文章western的方法，看不懂了

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-2-15 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】JBC的一篇文章western的方法，看不懂了


原文是这样的
Cells were washed twice in phosphate-buffered
saline (PBS) and lysed directly by the addition of Laemmli buffer (60
mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% (w/v) glycerine, 3% (w/v) SDS, 5% (w/v)
-mercaptoethanol, and 0.05% (w/v) bromphenol blue) and boiling at
100 °C for 5 min.然后直接转膜了Total protein extracts were separated on SDS-polyacrylamide
gels and then transferred to nitrocellulose membranes in a
buffer containing 25 mM Tris (pH 8), 190 mM glycine, and 0.1% (w/v)
SDS using a tank blot procedure. Blotting was performed at 800 mA for
1 h. The membrane was blocked for 1 h at room temperature on a
platform shaker in PBS supplemented with 5% (w/v) nonfat dried milk
(Carnation) and 0.05% (v/v) Tween 20 (PBS-T). Incubation with the
primary antibody appropriately diluted in PBS supplemented with
0.05% (v/v) Tween 20 and 5% (w/v) milk powder was carried out overnight
at 4 °C. Afterward, the blot was washed three times for 10 min
with PBS supplemented with 0.05% (v/v) Tween 20 and then incubated
with anti-mouse or anti-rabbit horseradish peroxidase-linked F(ab)2
fragments (Amersham Biosciences) diluted 1:3000 in PBS-T for 45 min.
Following three washes, the bands were visualized with the ECL detection
system (Amersham Biosciences). Bound antibodies were removed
from the membrane with stripping buffer (100 mM -mercaptoethanol,
2% (w/v) SDS, and 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7) at 50 °C for 30
min followed by three washing steps in PBS-T and incubation in blocking
buffer.，我想问细胞怎么没有用裂解液啊，laemmli
buffer 看似是loading buffer 啊，怎么可以当作裂解液吗？
现在想测alpha-SMA蛋白，却不知道用什么裂解液了，极度的迷惑，选择太多了，反而无从选择？即到底行不行？？没有底啊，毕竟试验的抗体和试剂太少了，不能再浪费了。
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-2-15 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

裂解液的选择确实很值得说说。
以下是2X Laemmli Buffer的成分:
4% SDS，20% glycerol，10% 2-mercaptoethanol，0.004% bromphenol blue，0.125 M Tris HCl。可以说这个就是常用的上样缓冲液的成分。
以下是RIPA裂解液的成分，RIPA也就是我们常用的细胞裂解液：
50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，此外还可以加入一些蛋白酶抑制剂，如PMSF，NaF，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。
通过比较我们可以看出，其实上样缓冲液中含有常规的细胞裂解液中的主要成分，去污剂、还原剂，因此作为裂解液其实是一种很不错的选择。我们在做细菌裂解的时候，常常都选用2X的上样缓冲液来当裂解液。
对于您的alpha-SMA蛋白，是一种胞浆蛋白，所以两种操作都没有问题，但是我还是想谈谈在使用这两种裂解方法的时候的一些体会：上样缓冲裂解法一般比较快，整个操作过程较短，对于一些较易降解的蛋白可以采取这个方法，但是由于含有指示剂其定量有一定误差，而且对于大量的细胞释放的核酸较难去除（可以用超声剪切，或者煮完后离心，以上清上样），细胞碎片较多；而RIPA裂解法（这只是一个基础配方，可以根据不同的亚细胞部位或目的蛋白进行调整去污剂或蛋白酶抑制剂的含量，种类）灵活性较好，蛋白测定相对较准确，调整蛋白浓度方便，但是操作过程较长，需要冰上放置。
可根据自己的喜好和具体条件进行选择，对于裂解液中各种成分的具体作用，您可以搜索一下本版，相信会给您一个满意的答案的。
给您一个网址，以便参考：
cuturl('http://www.beyotime.com/lysis-buffer.htm')
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-2-15 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢斑竹热心的回答。我这里又看了很多文章，其实每篇文章的裂解液的配方都不一样，还有我们实验室的也更离奇（仅有蔗糖和NA3N和磷酸钠缓冲液：不知斑竹见过没），说实在的，我为寻找一个标准的或者说合宜的适合我的细胞（NIH3T3)的裂解液，已经看了一周了，一直在彷徨。到底选什么啊 ，有没有标准了？其实我知道可能是我刚做的缘故，对各种成分的确切作用没有掌握，这里又是两个
1 0.1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 7.5, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA,
50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM dithiothreitol) containing 1 mM phenylmethylsulfonyl
fluoride (PMSF) and Complete protease inhibitor
2 Cells were rinsed with phosphate-buffered saline and
then lysed with cell lysis buffer (10 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, 1%
Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.004% NaF, 1 mM
NaVO4, 25 mM _-glycerophosphoric acid, 100 _g/ml phenylmethanesulfonyl
fluoride, and 1 _g/ml each aprotinin and leupeptin, pH 7.35). The
lysates were clarified by centrifugation at 12,000 _ g for 10 min at 4 °C.
Protein concentrations were determined using the Bio-Rad DC
protein assay.
我想对我来说只要管用，越简单越好，用的越少越省钱哦（经费早超了，还没有结果），但是保证结果最重要啊，所以还是迷茫。。
另外有一件事情请教，如果我收了细胞暂时不做，该如何保存呢？上一次高速离心机坏了，我刮下细胞后带着PBS就-80°冻上了，也没有加裂解液。
那么正确的方法是什么呢？可不可以收了细胞离心后把细胞沉淀冻起来？抑或是裂解完然后测完蛋白弄得冻起来？
请指教。
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-2-15 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个问题，问的有点多了，但是很无奈，两周了，没有进展，我很郁闷的慌啊。。天天呆在实验室琢磨这些没用的东西，真是很糟。。废话少说。
在oxford大学出版的Hames_Gel Electrophoresis of Proteins-A Practical Approach 这本书中2*sample buffer是这样的
Table 9. Composition of SDS-PAGE sample buffers
2 x sample buffer for discontinuous gel systems
Stacking buffer (0.5 M Tris-HCI pH 6.8) 2.0 ml
Glycerol 1.6ml
10%SDS 3.2ml
2-mercaptoethanol 0.8 ml
0.1% (w/v) bromophenol blue in water 0.4 ml
Store at 4°C for up to three months
2 x sample buffer for continuous gel systems
0.5 M sodium phosphate buffer pH 7 0.64 ml
Water 1.36ml
Glycerol 1.6ml
10%SDS 3.2ml
2-mercaptoethanol 0.8 ml
0.1% (w/v) bromophenol blue in water 0.4 ml
Store at 4°C for up to three months
与其他的书有些不同，但是我 感觉这个应该比较权威吧。所以基本上都想按照它的配方，但是有点疑问，难道没有双蒸水吗？所有的加起来是8ml，会不会有2mll的dd-W呢？
transfer buffer 我还没有找到一个配方？请斑竹给指一个吧。谢谢了
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 小中大

你所提到的oxford大学出版的第一个上样缓冲液，就是用于不连续凝胶体系的电泳缓冲液，也是我们实验室一直在用的。我们一直在用，没有问题。总共体积就是8ml，楼主这个不用怀疑。
我们用的转印缓冲液的配方是：
Tris 3.033g , Gly14.42g, 甲醇200ml, 加水至1000ml 用2次。
（或 Tris 12g , Gly 57.6g , 甲醇800ml, 加水至4000ml）
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 小中大

首先，如果想仅靠查文献就想一次搞定western，几乎是不可能的，当然，除非您所在的实验室有非常好的技术支持。
其次，我在第一贴里已经说了，这种蛋白，这种细胞，一般的RIPA足够了，况且您想选择一种标准的裂解液，这也是不可能的，因为本来裂解液的基本成分就这几种，其余的无非就是缓冲的差异和同一种成分其他试剂的更换，万变不离其宗。我们还有很多裂解液的配方，最简答的就是PBS/DTT，不过要用超声破碎来裂解细胞，这个其实已经不叫裂解液，只能叫裂解缓冲液。
不得不说裂解细胞的方法其实有很多，用去污剂裂解只是其中一种，属于化学方法裂解，还有超声破碎，反复冻融，低渗，液氮研磨，以及匀浆，这些属于物理方法裂解。因此裂解液当然有不一样了，您说的那种不是低渗就是需要研磨或者超声的。
再次，如果不能提取细胞蛋白，最好用胰酶法收集细胞，然后洗涤两次，弃上清，将细胞沉淀冻存于-80度，建议尽快提取。
最后，我还是想说分子生物学的圣经《分子克隆》里的东西确实非常经典，我们一直沿用上面的配方，没有问题，因此不必寻找更多的配方，基础的实验技术直接按照上面的guideline来即可。祝您成功！
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xue258[使用道具]
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 小中大
不知道版主有没有做过2D啊，我目前做2D，后面要做Western
想问问版主，2D的样品能不能用来做Western
我的裂解液配方是：
脲，CHAPS,DTT,Tris，蛋白酶抑制剂混合物（protease inhibitor mixture，sigma）
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ladyhuahua[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 avi317 于 2014-2-15 14:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你所提到的oxford大学出版的第一个上样缓冲液，就是用于不连续凝胶体系的电泳缓冲液，也是我们实验室一直在用的。我们一直在用，没有问题。总共体积就是8ml，楼主这个不用怀疑。
我们用的转印缓冲液的配方是：
Tris 3.033g ,  ...

你好，你用的是半干转印吧。我们的仪器是bio-rad mini-cell 不知道合适不
好像有个湿式的配方 48mM TIIS 39mM甘氨酸 20%甲醇 0.0375%SDS 加水至1000ml
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