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标题:【求助】蛋白中含有250mM咪唑，能否口服灌喂大鼠？

qhyu[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白中含有250mM咪唑，能否口服灌喂大鼠？


我的蛋白是原核中以包涵体形式表达的，理论分子量7k，含His标签，用不含尿素的250mM咪唑洗脱液柱上复性洗脱。
拟脱盐后质谱检测分子量、序列，并口服灌喂大鼠。采用3k超滤管脱盐后蛋白全部损失，C18 tip脱盐结果也如此，用3.5k透析膜以纯水和PBS透析24h后产生大量沉淀。
现在问题如下：
1、采用何种脱盐方法？sephadex G10脱盐柱？
2、能否用含250mM咪唑的洗脱液口服灌喂大鼠？主要想检测该蛋白的治疗效果，250mM咪唑会产生何种副作用？
多谢各位了！
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发表于 2014-2-15 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 qhyu 的帖子

建议采用脱盐柱脱盐
G-25脱盐或G-100
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发表于 2014-2-15 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.无论透析或超滤，都有一个分子量范围，一般处理的蛋白的分子量应该是膜界限的3~5倍才不会造成大的损失，因此7k的蛋白（多肽）选择2k或者1k的超滤膜比较合适。
2.G25脱盐处理小于9k的蛋白都不太合适，蛋白会进入凝胶小孔中；G10应该可以
3.透析应该采用逐步降低缓冲液离子强度的方法，变化太剧烈（譬如直接换成水）蛋白会立刻产生沉淀。
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小于3K的超滤管和透析膜都找不着，看来只能试试梯度透析和G10柱了。
另外有没有高人知道咪唑的口服安全浓度啊？动物实验造模的成本太高，又不能试，而且时间也来不及了
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发表于 2014-2-15 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白是原核中以包涵体形式表达的，理论分子量7k，含His标签，用不含尿素的250mM咪唑洗脱液柱上复性洗脱。
拟脱盐后质谱检测分子量、序列，并口服灌喂大鼠。采用3k超滤管脱盐后蛋白全部损失，C18 tip脱盐结果也如此，用3.5k透析膜以纯水和PBS透析24h后产生大量沉淀。
一个可能的问题是你的蛋白没有复性，所以，用3.5k透析膜以纯水和PBS透析24h后产生大量沉淀。
现在问题如下：
1、采用何种脱盐方法？sephadex G10脱盐柱？
如果没有复性，同样会沉淀。
2、能否用含250mM咪唑的洗脱液口服灌喂大鼠？主要想检测该蛋白的治疗效果，250mM咪唑会产生何种副作用？
估计没有人能说清楚250mM咪唑的副作用，尤其在与你的蛋白一起给药时。核心问题是如果你的蛋白不具活性，你有必要口服灌喂大鼠测定？
多谢各位了！
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
洗脱蛋白的时候用的是不含尿素的洗脱液，洗脱液中无沉淀，且SDS-PAGE可看到目的条带，所以我认为该蛋白已复性完成
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发表于 2014-2-15 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

洗脱蛋白的时候用的是不含尿素的洗脱液，洗脱液中无沉淀，且SDS-PAGE可看到目的条带，所以我认为该蛋白已复性完成
不沉淀并不意味着复性了，SDS-PAGE做了非还原了吗？
有些多聚体可以在溶液中溶解，但在上柱、透析等时容易沉淀
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