【求助】毕赤酵母表达条件如何优化？

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标题:【求助】毕赤酵母表达条件如何优化？

greenbee[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位前辈大家好，我是做毕赤酵母表达的，现在已经研三了做了快一年10KD的蛋白一直没表达，毕业成问题啊，急得我晚上天天睡不着觉，现在不知道到底是我们的菌株（GS115）有问题，还是诱导表达的条件不对，抑或是我们的蛋白压根在毕赤酵母中就不表达，想请问一下各位的蛋白是不是已经表达了，能不能慷慨借我一点您的酵母菌株比如说KM71 X33等，我想换换菌株是不是能表达出来，或者如果您能把您构建好的让我做个对照那是最好了，我没有其他的意图仅仅是为了我的实验，我愿意用我愿意以积分交换或者money哦（大家别看我分比较少，我的小老板有好多分的哦），谢谢前辈们了！（我在商丘）大家可以PM我哦！
另外我想优化酵母的表达条件，不知大家能否给我一些指点，比如温度上（低温效果不知如何），培养基的PH值、MUT+和MUTs的诱导起始菌体浓度等等。再次谢谢各位了！

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先要确定你的载体构建没有问题。注意你的基因序列里有没有明显会影响表达的因素。比如移码突变，突变造成的终止密码子及可能导致酵母转录终止地序列比如：TTTTTATA;TATATA,TACATA,TAGTAGTA等。感觉优化密码子并不是很有效。
其次，确定你的蛋白是分泌表达还是胞内表达。有时候虽然设计的是分泌表达，但由于未知原因，目的蛋白没有分泌出来。所以一定要同时检测表达上清和胞内组分。
再次要有好地检测方法。如果检测方法灵敏度不够高，那就很难有根据地系统地优化表达条件了。你说没有表达不知道是用什么方法检测的？
个人感觉除了少数特例外，大多数情况下低温诱导，换菌株，mut+,muts等措施都没有多大作用。最确切有效地是提高诱导起始菌体的密度，如果有条件可以上小罐发酵。通常比摇瓶至少提高表达量5－10倍。培养基的话最好用丰富培养基比如BMMY。
对某些蛋白而言，pH值确实会有影响。可以尝试一系列不同pH值的培养基
从3.0－7.0不等。pH值高于7.0时培养基会有沉淀，所以一般在7.0一下尝试。
添加1％的酸水解酪蛋白也是可以尝试的方法。但也只对少数中性蛋白酶敏感的蛋白有效。
如果所有的条件都试过，还是没有改善，那也是没有办法的。
研三了，要换课题比较困难(当年我也是同你一样焦头烂额，万幸后来被我蒙混过关了，呵呵)。一般来说，只要能够检测到表达，毕业就不成问题了。而绝大多数蛋白都或多或少会有表达的，只是看你能不能检测到而已，所以我要再强调一句，好的检测方法很重要。

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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先谢谢前辈这么系统的回答！
理论上我的蛋白是分泌性表达，我也曾经跑过沉淀但是也没有看到目的蛋白，因为试验条件有限我们没有做Western，仅仅通过SDS-PAGE电泳TCA浓缩检测不到目的蛋白（我用过1ml浓缩条带不清楚后就20ml浓缩但仍然看不到）；因为目的蛋白的抗体比较贵，除了Western还有没有其他可以检测表达的方法啊？
之前我在园子里看到有人说过可以先用小试管5ml表达，20小时后我发现浓度没有用三角瓶摇的浓，并且这次我尝试用20度来诱导，我通过查一些资料也发现好多人都认为诱导起始的菌液浓度是个很重要的条件，我也准备试一下。
我在expacy这个网站上测到我的蛋白的等电点是5.28，但是我不知道确切的应该怎么去调BMGY和BMMY的PH 值，前辈能否给我一点建议？对了如果要尝试不同PH值的话，那我只需要去调磷酸缓冲液的PH值吗？
我发现了现在毕赤酵母表达是一个普遍的难题，好多同仁都比较头疼它，真希望我优化的条件有一点突破也能给大家一个借鉴。
再一次谢谢您的帮助！

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SDS-PAGE的灵敏度很低，只有表达量很高的重组蛋白才能在SDS-PAGE上看到清晰的条带。
如果有抗体的话，最好先做一个Dot-blot，其优点是抗体用量少，灵敏度比Werstern-blot高，也比较简便。如果目的蛋白是酶的话，可以检测酶活。如果目的蛋白是生物活性物质，比如激素，可以检测其生物活性。总之一句话，首先要用最灵敏的方法确定到底有没有表达。
关于培养基的pH值，我的配法是，不要加磷酸缓冲液，直接用磷酸调pH值，然后灭菌后添加YNB。

xue258[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SDS-PAGE检测10kd的蛋白可能效果不大好吧，你可以试试tricine-sds-page，可检测到3kd，也就是分离胶中添加了甘油后，利用分离胶-夹层胶-浓缩胶三层不连续胶制备而成，具体内容你可以在丁香园上找，有很多的，我当初也是从这里找到的，希望能对你的试验有所帮助！

greenbee[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢楼上两位前辈！
正如大家所说SDS-PAGE的分辨率确实很低，但是我在园子里也看见有人表达10KD的蛋白在PAGE胶上看到清晰的带，因为这个蛋白我们已经在原核中成功表达跑PAGE胶并且条带很清晰，所以我就没用tricine-sds-page，不过确实可以试一下。我会和老板商量一下买抗体来检测一下。

greenbee[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

表达手册上说配制BMGY时先“溶解 10g酵母浸出物，20g蛋白胨于 700ml水中；灭菌 20min 冷至室温后加入100ml 1M 磷酸钾缓冲液 PH6.0 ，
100ml 10×YNB ，2ml 500×B ，100ml 10×GY ”，那您的意思是不是我先溶解 10g酵母浸出物，20g蛋白胨于 700ml水中，直接用磷酸调PH值，灭菌后再加YYNB 500B 10GY,就不再加入磷酸缓冲液了，那其他成分的量不变吗？还是要调整？
呵呵还想问一下nan0791前辈，能否把Dot-blot的操作步骤也给我说一下啊？谢谢了！

shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2014-2-15 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

培养基的配方确实如你说的那样，直接磷酸调pH值，灭菌后再加YNB，更妥善的方法是灭菌后加YNB和0.1M KCl以补充钾盐。pH值调到4.0以下也会有少量沉淀，不过不影响使用。另外，在低pH条件下，酵母生长速度会受影响。所以，建议只对BMMY培养基调pH值，BMGY培养基不用调。
以下是我做DOT-BLOT的步骤
一、Dot blot 步骤
1.  剪一小条PVDF膜，用铅笔划成1平方厘米左右的小格；
2.  将PVDF膜在甲醇中浸泡30s，随后转至去离子水中，浸泡5分钟；
3.  将PVDF膜表面的水分用滤纸轻轻拭干，随后平放在用水湿润的滤纸上。
4.  取3-5微升样品点在滤纸的各个小格子中。待膜上点的样品完全吸收后，将膜浸入封闭液中（20mMTris-Hcl pH=7.4,0.9%NaCl,0.05%Tween-20,5%脱脂奶粉），室温封闭1小时或4度过夜；
5.  TTBS（20mMTris-Hcl pH=7.4,0.9%NaCl,0.05%Tween-20），洗三次，每次5分钟；
6.  加入TTBS稀释的一抗结合1小时；
7.  TTBS（20mMTris-Hcl pH=7.4,0.9%NaCl,0.05%Tween-20）洗三次，每次5分钟；
8.  加入TTBS稀释的酶标二抗结合1小时；
9.  TBS（20mMTris-Hcl pH=7.4,0.9%NaCl,）洗三次，每次5分钟；
10.  浸入显色液显色。