【求助】关于包涵体溶解

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于包涵体溶解

12 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】关于包涵体溶解

49888[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77494
精华 0
积分 776
帖子 1211
信誉分 100
可用分 6906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2014-2-20 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位大侠，我诱导了200ml菌液，加入多种酶、破菌后，低浓度尿素洗涤，用8M尿素溶解包涵体，完全悬浮沉淀后，液体呈淡红褐色，4度过夜，离心后仍有很多沉淀。这沉淀吹打时有些粘稠，红褐色。电泳结果显示，沉淀中仍有目的蛋白。这种现象一直存在，总有部分沉淀不溶，而且有颜色。
1、我总觉得超声破菌那步有问题，是破菌不充分还是过了？有人用结晶紫染色后镜检。如果不染色的话，在镜下能够分辨吗？
2、低浓度尿素梯度洗涤包涵体的目的是什么？是洗杂蛋白，促进包涵体溶解吗？我曾用1M、3M、5M充分洗涤包涵体，沉淀的颜色逐渐加深，结果8M溶解时，混合液体颜色是深红褐色，离心后还有不少沉淀。这是怎么回事？难道尿素反复洗，和蛋白起什么反应了？
3、总有不溶解的包涵体，怎么办？换盐酸胍？有资料说，盐酸胍溶解的包涵体在蛋白复性过程中问题比较多，是吗？
3、离心后的上清有颜色，这种状态能上柱子吗？
这些问题怎么解决好呢？这个实验总是在这步出很多状况。谢谢大家！！请帮我解决一下！急切等待～

阿k[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76208
精华 0
积分 262
帖子 222
信誉分 101
可用分 1886
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2014-2-20 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.你指的超声有问题是值影响什么，不管破壁充不充分，包涵体是肯定的，过点也不可能把包涵体超会溶解状态，过点没事，有可能有一部分可溶性的留在超声上清里
2.洗涤当然是让包涵体部分更纯一些，就像你说的洗杂蛋白，还能出掉一部分膜蛋白，这个过程一定要有的，之后8M溶解的目的蛋白在柱上复性或纯化时会更容易一些，颜色好像没大问题，没遇到过，不过有的包涵体就是红褐色的，离心后的沉淀就不要留了，可能含有大部分是酯类和细胞碎片啥的，所以很粘
3.不溶的不要也行，应该不是很多吧，回收蛋白纯化蛋白回收率不可能是100％，肯定会有损失的，盐酸胍基本上蛋白全部变性，复性的概率比较低
4.这个颜色问题好象没有影响吧，只要样品离心了，过滤了，不堵柱子，不是沉淀，上柱没问题
唉能不处理包涵体还是尽量让它们可溶性表达吧，还载体还表达菌，摸索诱导条件，包涵体不好复性啊

daod[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76758
精华 0
积分 585
帖子 790
信誉分 100
可用分 4891
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态离线

发表于 2014-2-20 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你提取的蛋白是要保持活性的吗？如果不需要保持活性，只需要把你的菌体沉淀溶解在含有8M尿素的缓冲液中溶解两小时，离心，你所要的蛋白就在上清中了，我们实验室用它做了N个蛋白，没有问题的。参考Qiagen蛋白回收的使用说明。

redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2014-2-20 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、我总觉得超声破菌那步有问题
要判断超声破菌有没有彻底破碎，可以超声后革兰氏染色镜检（可以用没破碎的菌做对照）。经验是菌体破碎充分后，不粘稠，比较清亮。
2、低浓度尿素梯度洗涤包涵体的目的是什么？是洗杂蛋白
主要目的是洗掉杂蛋白。可在低浓度尿素洗前先用Tris缓冲液洗，这样可将包涵体洗的更干净。
3、不知楼主用了多少ml尿素溶解包涵体，可以多用点。如果包涵体溶解后很粘稠，那多半是超声破菌有问题，菌体DNA打断不充分。
4、溶解包涵体后4度过夜，让其充分溶解。
5、如果还是有不溶的包涵体，不要它了，离心，过滤，上样。

guagua[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态离线

发表于 2014-2-20 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哎呀，恍然大悟，如果粘稠的话是DNA的影响，那就是破壁不充分，如果是胶状冻块状的东西，那就是细胞碎片了，恩应该是这样了

wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态离线

发表于 2014-2-20 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2.洗涤当然是让包涵体部分更纯一些，就像你说的洗杂蛋白，还能出掉一部分膜蛋白，这个过程一定要有的，之后8M溶解的目的蛋白在柱上复性或纯化时会更容易一些，颜色好像没大问题，没遇到过，不过有的包涵体就是红褐色的，离心后的沉淀就不要留了，可能含有大部分是酯类和细胞碎片啥的，所以很粘。
用低浓度尿素反复洗后，包涵体沉淀颜色逐渐加深，真是很奇怪，不知道哪里错了。
4.这个颜色问题好象没有影响吧，只要样品离心了，过滤了，不堵柱子，不是沉淀，上柱没问题
我上次将这种状态的上清过柱子了，结果柱子颜色变褐色了，倒是没堵。但是柱子的结合力下降了，难道是导致脱镍了？这次我也不敢上柱子了。
太感谢了！！

49888[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77494
精华 0
积分 776
帖子 1211
信誉分 100
可用分 6906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2014-2-20 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、我总觉得超声破菌那步有问题
要判断超声破菌有没有彻底破碎，可以超声后革兰氏染色镜检（可以用没破碎的菌做对照）。经验是菌体破碎充分后，不粘稠，比较清亮。
这个方法好啊。我做的破菌后液体颜色像豆浆，不粘稠，这样正常吗？
非常感谢！！

49888[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77494
精华 0
积分 776
帖子 1211
信誉分 100
可用分 6906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2014-2-20 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哎呀，恍然大悟，如果粘稠的话是DNA的影响，那就是破壁不充分，如果是胶状冻块状的东西，那就是细胞碎片了，恩应该是这样了

===========================================

你指的是什么？用8M尿素溶解的包涵体离心后沉淀吗？

cwcwcww[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 101434
精华 1
积分 311
帖子 277
信誉分 102
可用分 2191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2012-12-3
状态离线

发表于 2014-2-20 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是有点像豆浆，正常的，400W,4-5 min超声应该可以充分破碎了
当让你也可以采用如下策略让菌体裂解更充分
加入溶菌酶后37度作用30 min(溶菌酶最适温度是37度）
冻融两次。
如果还嫌麻烦加入溶菌酶后直接4度过夜

49888[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77494
精华 0
积分 776
帖子 1211
信誉分 100
可用分 6906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2014-2-20 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，你在啊，太好了！
我按照《分子克隆》加了各种酶和脱氧胆酸，加完后菌液很粘稠，又加的DNas ，溶液不粘了。然后破菌。400w，工作10s，休息10s，120组。是不是已经够充分了？除非那个超声破碎仪指针有问题。

12 1/2 1 2 ››