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标题:【求助】关于pet30a原核表达

yychen[使用道具]
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发表于 2014-2-20 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于pet30a原核表达


各位大侠，小弟最近做原核表达时遇到很奇怪形象，我用的是pet30a，表达目的基因时野生型表达不出来，突变体能表达出来，突变体和野生型只有单个氨基酸替换，测序均没问题，***各位大侠高手帮帮小弟一把！！！
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-2-20 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
野生型菌体能长么？
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yychen[使用道具]
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发表于 2014-2-20 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 qianqin1977 的帖子

能长,摇菌也没出现什么问题,不知是什么原因
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-2-20 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 用新鲜转化的菌，
2. 野生和突变的同时做，排除系统问题，
3. 什么氨基酸的突变？如果你能严格证明，本身就是很有意义的课题。
4. 是否是稀有密码子的问题？
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发表于 2014-2-20 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正如楼上说的那样野生和突变同时做一次；
另外，有可能野生型的表达产物对宿主有毒性，这种毒性不会阻碍宿主生长但是有可能导致质粒丢失，从而导致无表达。
还有，可能野生型在宿主体内是某种酶的特异底物，被降解了，所以检测不出表达产物！
个人意见，不对的地方请指正，谢谢！
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yychen[使用道具]
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发表于 2014-2-20 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是G替换成Ｖ，楼上的方法我试了还是表达不出来，我已经换了很多条件就是不行，我也很奇怪，sixinxi的意见很好，我觉得可能就是这个原因，但如何解决呢，还望赐教！！！
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发表于 2014-2-20 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能需要换不同的宿主菌了，或者相关酶缺陷性的同种菌株。
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yychen[使用道具]
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发表于 2014-2-20 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我已经换了很多宿主菌，BL21(DE3)，
BL21(DE3)PLYsS还有 rosstal等 都是野生型表达不出来，预测了也不是稀有氨基酸啊
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发表于 2014-2-20 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BL21(DE3)PLYsS是用来降低本底表达的，如果你的细胞在涂有IPTG的板子上能生长良好没必要试这个菌株；
rosstal 是用来表达含有稀有密码子的蛋白，G到V，在E.coli里不涉及密码子的问题；
还是想知道楼主是不是用的新鲜转化的菌，是不是同时和能表达的菌一起做的，有没有试不同的colony
感觉你应该是测序了的对吧？
个人意见供参考
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yychen[使用道具]
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发表于 2014-2-20 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是从刚转化过的板子上挑的单克隆,先前在南京做是这种情况,现在到北京重新转化了也挑了不少单克隆,但实验结果是一样,我两个亲本都是一起做的,所有条件一样.我拿转化过的BL21测序了,载体构建均没任何问题,真的不知是什么原因,我想问问有必要换载体吗?
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