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标题:【求助】目的条带快快现身吧

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发表于 2014-2-22 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】目的条带快快现身吧


这段时间WB的结果就像是道填空题，出来的题干都是我知道的，但最想看到的目的条带的情况就是不现身，空缺在那！我的目的蛋白是17KD，用的是0.22um的PVDF膜，半干转膜150mA1小时，后3%的脱脂奶粉和3%的BSA封闭1小时，一抗1：500，二抗1：5000，中间用TBST洗40分钟，ECL发光显影，actin和阳性对照都出得非常好，但就是目的条带那片有一片模糊的背景，看不清条带，曝光之后用立春红染膜，相应位置上至少有两个泳道是肯定有蛋白条带的，还很粗，而且其余泳道理论上也绝对是有的，而且也在WB的检测灵敏度之内，但膜上条带不明显，我的是胞浆蛋白，是不是我的前期裂解制样有什么不对啊，我用的是RIPA裂解液，成分是50mmol/L Tris.Cl(PH7.5)
150mmol/L NaCl
1% NP-40
0.5% DOC
0.1% SDS
制样的时候最后再加PMSF，PMSF的工作浓度是10%，有什么问题么？请各位战友一起帮忙分析分析吧，这种结果重复了好多次了，自己实在找不出还有什么能改进的地方了
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发表于 2014-2-22 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是可以加大上样量？除此以外还有什么好办法么？
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发表于 2014-2-22 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PAGE胶的浓度是多少?
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发表于 2014-2-22 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下层胶12%，上层胶5%
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发表于 2014-2-22 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.换15%的胶试试看.
2.你裂解细胞后加入的Loading buffer是否足量?有没有加还原剂例如beta硫基乙醇?煮沸后离心有没有什么问题?
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发表于 2014-2-22 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢帮助！
1、只是我不太懂为什么要更换胶的浓度啊？我的marker看上去跑的还行啊
2、我是从组织中提取的，loading buffer是严格按照倍数换算的，还原剂用的是DTT，我是离心吸出上清后再加的loading buffer和DTT，然后煮沸，过程顺利，有什么问题么？
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发表于 2014-2-22 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.MARKER的蛋白量很大,所以不能完全代表样品的电泳情况.17KD的蛋白质的最佳分离胶浓度是15%,当然12%也是可以的.
2.虽然是组织裂解后的上清加入loading buffer煮沸的,还是要再次12000g离心10分钟后再取上清电泳.
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发表于 2014-2-22 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，原来是这样啊，那我现在制好的样需要再做一次离心是么？我有的时候在电泳前会把样品再简单离心一样，这样可以么？
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发表于 2014-2-22 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样前再用12000g离心5-10分钟就可以了.
不过WESTERN的结果是否漂亮,个人认为主要还是取决于目的蛋白的丰度以及抗体的灵敏度,所以如果技术上都没什么太大问题的话,还是要考虑一下目的蛋白和抗体的问题.
祝你好运.
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 小中大

谢谢大家的帮助！我还想问：如果免疫组化能做出的蛋白，再用WB检测，半定量，不会因为蛋白表达量太少做不出来吧？
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