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标题:【求助】转膜问题，急！

小野花[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】转膜问题，急！


beta-actin 为43kd ，用的是湿转，200MA 1h, NC膜，可以成功将蛋白转到膜上，今天用的是pvdf膜，0.22um孔径，同样是湿转 200MA 1h,结果转膜后丽春红染膜未见条带，请高手指点!不胜感激！
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glass[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

pvdf膜转膜前需要比较严格的处理程序，包括用甲醇浸泡20min后再用转膜缓冲液浸泡等等，你可以在网上查查pvdf膜处理的程序再看看
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小野花[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我现在要做10kd蛋白的WB,想请教下，电泳，转膜的条件，以及需要注意些什么？
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feima+[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.转PVDF膜时,首先膜要先用甲醇浸泡,浸泡时间一般是1-20分钟,我用的是5分钟,甲醇浸泡后用转移液浸泡,浸泡时间我用的是比较长,我一般是用两小时,就是早早的就把转移液放到盘子里,海绵,滤纸也都放到里面.把PVDF膜泡透是比较重要的一步.
2.转移液要经常换新的,一般认为转移液可以用3-5次,但是我都是用两次就换新的,感觉次数多了.就不好用了,容易导致转膜的时候转不上,或者使膜上的蛋白条带发生弯曲,偏移,分散.
3.转膜的时候容易产热,所以转移槽里面最好加冰槽.我是里面加兵槽,外面用冰围起来(把转移的装置放在塑料脸盆中).这样的转移效果比较好.我用的是MILIPORE 的PVDF膜 ,我用的转移时间是300毫安半小时.当然膜不同,转移装置不同,所用的转移时间也可能不同.
4.还有很重要的一点就是,当膜上染色没染出来时,暴光的时候也可能出现条带,只是条带可能比较弱,暴光时间要长一点.
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我转膜的时候根据预染Marker,我刚开始摸条件都是用两张膜，一两次就能摸出条件了，你试试。我测的是36kD，100V，1h，电流在200-400mA。
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小野花[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在要做目的蛋白为10kd的wb，想请教下转膜条件可以和内参的一样嘛？内参已经暴出来了，43kd. 200mA，1h.
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小野花[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天将pvdf膜在甲醇中浸泡20分中，然后放入转膜缓冲液中浸泡20分钟，再进行转膜，结果膜上可以看到maker，但是用丽春红染膜，8－16kd间未见任何蛋白条带，而同时用NC膜转的30－50kd之间均可见蛋白条带，请问这是什么原因啊？
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发表于 2014-2-22 23:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哎！
1. 不需要浸泡！！！（大家不要忽悠人了，好不！？）
甲醇全湿30sec，转膜液1分钟即可，但你要晃动晃动膜，保证上下表面都完全沾到转膜液即可。
2. 完全没必要用立春红染色。膜上可以看到marker，你已经转成功了。
为啥出现差异！？——这个结果已经说明立春红染色是多么stupid的步骤。
A. 现在多数实验室已经用预染的Marker做实验，转膜情况如何只需要看看Marker的深浅。B.增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白并不好。C. 浪费时间。如果可以直接看Marker深浅指示转膜效果，何必再多此一举！？（我在别的帖子上回的，copy过来）
NC膜由于带负电荷更易吸附蛋白，所以常规情况下，NC膜的转膜效率会显著高于PVDF，达到了立春红的识别的区间，所以出现条带。但你能说10KDa左右的没转过去吗！？——浓度！浓度！超出识别的阈值了！！！
其实你没必要割成两张膜转膜（当然如果你想省钱例外）；你自己都说了，预染marker转过去了，So just Continue, What r u waiting for!???
我推测你提问的原因是后面出现问题了（如果是我肯定不管3721继续做下去），所以会担心转膜有问题。但我明确告诉你转膜没问题，那么哪儿有问题呢？估计你们的WB体系是根据NC膜构建的，这套体系不太适合PVDF。——为啥？
还是上文提到的NC膜吸附蛋白能力强，同样非特异性吸附抗体的能力也强（抗体也是蛋白），所以NC膜通常用高盐漂洗除背景，而高盐对抗体和PVDF都不是很合适的条件，所以如果你要启用PVDF膜，就必须另配一套WB缓冲液体系（封闭液例外，但通常封闭液就是抗体稀释液，而抗体稀释液最好不要用高盐的，在你没试验过可行性之前）
PS：不否认浸泡膜会对转膜有好处，但又不是难转的蛋白，何必多此一举，多此一举！
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小野花[使用道具]
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发表于 2014-2-22 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有问题请教：
1、预染marker在膜上可见，就说明转膜成功了吗？
2、我做的目的蛋白10kd左右，很多资料上说需要用0.22um 的pvdf膜，我想问下，可以用NC膜嘛？
3、 今天用ECL发光，内参（43kd)可以看见蛋白条带光，目的(10kd）未见，然后曝光10min，显影、定影各2min，未见蛋白条带。请问下什么原因？是显影的问题吗？
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feima+[使用道具]
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 小中大

用NC膜可以；Tat我们这么干的。
marker过去了就一定是转膜成功了，这个没问题。其实考虑改小孔径转膜无非顾虑转膜过度，你还担心转膜不够！？而且事实上我们转HIV Tat蛋白（86aa，p14）也只是用普通的0.45um pvdf，何况你还是用0.22um的。
对，我前面提过了，你有没有办法确定你的抗体没问题，if u sure Ab is ok，那么就是因为我告诉你的NC膜这套WB体系和PVDF膜的不兼容，你可以用PVDF的WB体系去做NC膜的WB（背景会升高），反过来不一定。
PS：你首先还需要确定Ab能不能用高盐抗体缓冲液稀释，高盐会破坏蛋白的空间结构。所以NC体系没问题的，PVDF体系都没问题，反过来就是不一定。
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