【求助】关于蛋白组学实验设计的请教，新手哦

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标题:【求助】关于蛋白组学实验设计的请教，新手哦

misswu61[使用道具]
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发表于 2014-2-27 10:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
腺癌
我是新手。我阅读文献好象SELDI_TOF_MS技术多数是检测血清样品。
我有个实验设计：培养95d腺癌细胞，RNAi技术，沉默A基因，提取A基因被封闭的95d腺癌细胞的蛋白，和未沉默A基因95d腺癌细胞的蛋白，SELDI_TOF_MS技术检测这两种蛋白，分析95d腺癌细胞中A基因沉默会引起那些蛋白发生变化，进步鉴定这些蛋白。
请各位高手指教，我这么设计能行吗？
非常感谢了

BOSS2011[使用道具]
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发表于 2014-2-27 10:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 misswu61 于 2014-2-27 10:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
腺癌
我是新手。我阅读文献好象SELDI_TOF_MS技术多数是检测血清样品。
我有个实验设计：培养95d腺癌细胞，RNAi技术，沉默A基因，提取A基因被封闭的95d腺癌细胞的蛋白，和未沉默A基因95d腺癌细胞的蛋白，SELDI_TOF_MS技 ...

SELDI 技术用在你的试验似乎不是最好选择.
SELDI技术的优点可以读：
cuturl('http://www.bio-rad.com') SELDI技术介绍。
Current Developments In SELDI Affinity Technology
Mass Spectrometry Reviews, 23, 34-44, (2004) Tang, N., Tornatore, P., Weinberger, S.R. 2004
SELDI技术差异表达流程如下图（from: cuturl('http://www.bio-rad.com')）, 你可以看到，鉴定差异峰还需要一步MS/MS.
选择研究方法要根据你的实验目的，像研究基因表达对其他基因,蛋白的调控还是用GENE CHIP技术比较好，蛋白组能发现的蛋白还是太少，特别是对基因调控蛋白，信号分子，受体这些丰度低的蛋白。　　

附件

2014-2-27 10:05

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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2014-2-27 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我试着回答一下，仅供您参考。
朋友，你的试验设计我个人觉得并无不妥，大概的想法和试验目的都体现出来了。不过真的要付诸实现的话，我还感觉需要再多点准备。
1.您实验室是否具有蛋白质组学的平台？
2.从您的试验设计上看，检测的水平是否只限于蛋白质水平？我想应该不是，基因水平也必定是需要检测的。正如gaobb朋友所说，技术也是为试验服务的，所以怎么选择，能更快更准的达成您的试验目的，还可以多看看类似的文献。
3.您的试验设计看起来是想寻找一些novel targets进行研究，那类似的大规模，大通量的平台，蛋白质层次有蛋白质组学，或者protein chip试验手段，基因层次有gene chip方法，诚然，两种方法必有差别，例如在灵敏度，准确性，性价比，所耗费时间上都有不同。如何取舍和选择，我个人建议您可以在对相应的试验技术有个大致的了解之后，再做定论比较好。
一点拙见，还望大家批评指教。

misswu61[使用道具]
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发表于 2014-2-27 10:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

正如楼上朋友所说，我的确是想通过这种方法寻找到A基因的novel targets。
本人的情况是研究经费有限，同时SELDI 技术在我们实验室就有，可以节省经费，所以有点逼着我用此技术来研究的意思了，呵呵。
朋友的见解让我受益非浅，准备再查阅相关文献，看来SELDI 技术并非最佳选择。
尚有一不成熟的问题：如果按我的设计，是不是得需要相当的运气，才能找到novel targets protein？

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发表于 2014-2-27 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你所做的是差异蛋白质组学研究，得到具有重要生物学意义的靶蛋白是研究的目标之一，获得的差异蛋白取决于你所采取的分离蛋白的技术手段，仅就技术而言，目前没有一种蛋白质分离技术是最佳的，只能根据实验蛋白样品和实验目的，选择最佳的方案。如果采用SELDI技术，很容易遗失低丰度表达蛋白和酸碱极性蛋白，差异蛋白肯定是有的，但novel targets protein 就不容易得到了，你可以先预想一下你所期待的靶蛋白或其相关蛋白有可能是何种蛋白，亚细胞结构，酸碱性如何，或者可能的作用通路，这样再选择蛋白样品的提取方法，结果可能会好一些。以上意见供参考。

vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-2-27 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
腺癌
培养95d腺癌细胞，RNAi技术，沉默A基因，提取A基因被封闭的95d腺癌细胞的蛋白，和未沉默A基因95d腺癌细胞的蛋白，SELDI_TOF_MS技术检测这两种蛋白，分析95d腺癌细胞中A基因沉默会引起那些蛋白发生变化，进步鉴定这些蛋白。
看起来也可以.但找差异蛋白有点难度,因为大多起重要作用的蛋白是低丰度蛋白,而他们有可能在操作中给降解了...所以看运气了....呵呵
我对血液方面知道的少,多参考他们给你的意见...

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发表于 2014-2-27 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不光是低丰度蛋白的问题，即使你用SELDI找到差异蛋白峰，你还是不知道该峰是什么蛋白，得把它纯化出来再做MS/MS才知道（Gaobb）。如果用蛋白组的方法2D+MS/MS可能有点希望，虽然该方法对低丰度蛋白也作用有限。

abc816[使用道具]
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发表于 2014-2-27 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你设计的实验足够硕士毕业了，但所得的结果没有多大价值，目前SELDI只能找出差异蛋白，但从差异蛋白分离纯化鉴定出何种蛋白太难了，其中一个原因是得到的差异蛋白可能是某个蛋白的部分肽段，可能是几种蛋白结合部分，这样并不能确定它就是一种蛋白，另外分离纯化所需的蛋白含量要很大才可能最终有鉴定结果，因为每一步纯化都会损失蛋白。没有几代学生是很难突破的，现今的报道也寥寥无几，俺个人认为所得研究没有多大意义。如果你实验室有毛细管电泳、电喷雾质谱等纯化鉴定仪器，以及成熟分离纯化的方法，可以进一步探索。但不同蛋白分离纯化要建立不同方法，因为蛋白的酸碱性未知。

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发表于 2014-2-27 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充一下，还要考虑下RNAi的脱靶效应。不知道你打算用甚么方法干扰，转载体，还是用pool siRNA？因为off-target引起的蛋白表达变化会有不少，直接干扰正确分析结果。

PINK[使用道具]
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发表于 2014-2-27 10:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

光找差异，没什么实际用途，前几年还能发不错的杂志，现在能发2分左右的吧。而且涉及到Rnai,这个东西很好钱的说，而且要求的条件也比较高，不知道你实验室有这个条件没有。时间上来说，需要2年以上时间。说穿了，就是找差异，打质谱。你沉默后，提蛋白。然后用粗提的蛋白，打质谱，这么个混合物，有意义？应该先将蛋白混合物跑个2D，在选点打质谱。设计上存在问题，实际操作要求高，最后文章档次低。基本可以否掉这个路线，现在过时了。当然，我是按sci的标准说的。估计老板不得批。

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