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标题:【求助】155KD蛋白western blot的经验

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-2-27 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】155KD蛋白western blot的经验


本人在做一个155KD蛋白的wb，提取的是胞浆蛋白，用碧云天的裂解液，跑的胶条带特别多，胞浆蛋白的提取是不是有什么特殊要求。有什么提取方法比较好！我用的10％的分离胶，6％的基层胶，基层胶80V,跑1h,分离胶200V，跑2h,胶特别脆，一揭就碎，什么原因引起的，是电压太高吗？国外就用200v呀，请高手指点，谢谢！
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-2-27 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在做iNOS，120多kda，提一些建议，供你参考：
1. 你所说的“胞浆蛋白”是什么意思？这有两种情况：（1）如果你是需要单独胞浆蛋白，还需要单独的胞核蛋白，那就只能是分部位提取。例如做NF-kB p65核转移，那就需要分别提取胞浆和胞核蛋白做WB。（2）如果你所说的蛋白是在胞浆表达，但是你不需要分开提取胞浆、胞核蛋白，那就用RIPA就行。例如GAPDH内参。
2. 155KD的蛋白最好用7.5%的分离胶，基层胶我用的是5%。分离胶浓度小，分离范围会更大，向你做的这么大的蛋白，我建议分离胶要跑6 cm，然后取上面的3 cm分离胶。最好是同时点样marker，先看看时间、距离、浓度参数与目的蛋白位置的关系。
3. 按照我的经历，10％的分离胶应该是不特别脆的，应该不会一揭就碎。你考虑是否家temed太多了，或者分离胶的浓度配错了。
4. “分离胶200V”还是没有这个必要吧。你很赶时间吗？基层胶80V,分离胶160V，是我常用的，或者60-120v也是常用的，甚至于100 v从基层胶开始就不管了，一直到我想要的跑的分离胶的距离，以我的经历，这几个参数问题都不大，不会影响结果的。
你还没有提到转膜，转膜还是一个让你恼火的问题，慢慢来吧，做实验没有一帆风顺的，天道酬勤的。good luck
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-2-27 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
高手，我是新手，刚做WB，我做的nNOS,我看文献说这三种酶都在胞浆，我提取后跑的胶条带很多，我用碧云天的western及IP裂解液，你用什么方法提取的，效果如何？我看外文用的200V，跑40分钟，我用200V，跑2H，溴芬兰才到底部。我还没做转膜，现在只跑胶看看。能否把你的7.5%的胶的配方给我，我在网上着的，其中没有SDS，我感觉那个方有问题，请给我一份，谢谢，邮箱liliang1639@163.com.希望我能多向你请教，再次感谢。
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-2-27 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“我用200V，跑2H，溴芬兰才到底部。”这要看你的WB装置的大小，我用的biorad mini，200V，跑2H溴芬兰肯定早就没影了，不清楚你的装置到底多大。以前看见过大的装置，个人感觉200V，跑2 h也是应该跑没影了的，所以有点不可思议。
我用的是RIPA buffer，这个配方在园子中有：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4330881&sty=3&keywords=RIPA%C5%E4%B7%BD')，RIPA buffer的配方不同人之间好像有一点点的不同，但是不影响效果。就用8%的胶试一试，差不多的。数字的单位都是ul。做WB一般都是SDS-PAGE，没有SDS我还是头一次见到这种配方的胶。没见过，不便评论。
浓度 8%
10 ml 5ml
DH2O2 4600 2300
30%Acry:Bis 2700 1350
1.5 M Tris(ph8.8) 2500 1250
10%SDS 100 50
10%AP 100 50
TEMED 6 3
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-2-27 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％）  线性分离范围（KD)
15   12-43
10   16-68
7.5   36-94
5.0   57-212
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 小中大

Odyssey® Western Blot Analysis
Western Blot protocal by MitoScience
附件中是上述两个公司的WB资料的PDF文档。首先说明：1. 这是从园子里找到的，不是我的原创，只是你再找估计又要费时间，既然我已经找到就拿出来，节约你的时间。2. 这两个文件对大家都还是有帮助的，但是还是要靠自己的摸索。我看了这两个文件，我的很多做法都同他们不同，所以只能是参考。多交流，多思考，多动手，也许是所有实验的guide。祝你成功！
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 小中大

我来提几点意见：
胶特别脆有两点原因，一个是由于你的电压太高，而且时间很有，这样产热很大，导致胶内水分遗失，所以变脆，建议你电压低点，或者加用降温设备，用水或冰降温，或者时间跑短点，在单位时间内电压越高分的越开，而在单位距离内，电压越低跑的越开，所以要根据你的蛋白的要求去调电压，200v是可以跑的，但是时间不要太常，而且最好有降温设备。
第二个原因就是你的转移缓冲液的甲醇浓度过高，导致胶变性凝固，一般甲醇浓度在20%左右，主要是加大膜对蛋白的亲和性的。
150kd用10%的胶的确不是很好，10%的胶150kd以上的蛋白基本上是跑不动了，跑出来的带也不会好看，建议用7.5%的胶跑。
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 小中大

胶特别脆有两点原因，一个是由于你的电压太高，而且时间很有，这样产热很大，导致胶内水分遗失，所以变脆，建议你电压低点，或者加用降温设备，用水或冰降温，或者时间跑短点，在单位时间内电压越高分的越开，而在单位距离内，电压越低跑的越开，所以要根据你的蛋白的要求去调电压，200v是可以跑的，但是时间不要太常，而且最好有降温设备。
第二个原因就是你的转移缓冲液的甲醇浓度过高，导致胶变性凝固，一般甲醇浓度在20%左右，主要是加大膜对蛋白的亲和性的。
150kd用10%的胶的确不是很好，10%的胶150kd以上的蛋白基本上是跑不动了，跑出来的带也不会好看，建议用7.5%的胶跑。
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 小中大
没有特殊要求的话，一般我们用RIPA是全细胞裂解液，所以提的蛋白肯定是膜蛋白、浆蛋白、核蛋白的混合物。假如要研究核转位等需要核浆分离，分开提取。
150多的分子量用10%的胶应该也能做，但建议用7.5%，凝胶电泳后蛋白分离效果好些。至于你说的每次胶都会变得很脆，原因分析我觉得tzt168938分析得有道理，电流太大，产热明显，胶的结构就变了，电泳效果不好，建议在4度冰箱电泳，同时泳槽四周加冰袋包围，以吸收这部分产热，实验室反复试过，效果很好！至于tzt168938说的加甲醇似乎搞错了，因为还没到转膜哩！
其实园子里Western高手如云，现成的步骤楼主可以检索后借鉴一下。
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 小中大

我目前也在跑155KD的一个蛋白条带，跑的也是胞浆蛋白。摸条件的时候用的分离胶是10%的，浓缩胶是5%。跑出来的效果还可以，后来8%的跑，奇怪的是跑的竟然没有10%的好，郁闷。现在改进的主要是转膜条件，甲醇用的是20%，转120分左右。
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