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标题:【求助】样品很少,却想鉴定很多蛋白,怎么办?

applebook=213[使用道具]
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【求助】样品很少,却想鉴定很多蛋白,怎么办?


细胞样品很难获得,蛋白量很少,但是又想鉴定出尽可能多的蛋白,请问我应该选择全溶液酶切加LTQ-MS/MS还是SDS-FT-LTQ-MS/MS,如果采取这种方式最少的样品要求是多少??谢谢!
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duoduo[使用道具]
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LTQ-MS/MS还是SDS-FT-LTQ-MS/MS, 楼主如果能用到这样的系统, 国内就算是北京和上海都没几家能做, 所以楼主在的是一个很强的实验室, 直接去问做样的人的吧。
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applebook=213[使用道具]
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我想应该尽量减少样品处理步骤,减少损失,同时选择高灵敏度的方法鉴定。但是后面是选择怎样的洗脱梯度?要分段扫描?
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831226[使用道具]
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多少ug蛋白?
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applebook=213[使用道具]
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呵呵,30ug不知道够不够?按正常细胞的大小和重量大概需要多少细胞呢?
现在我在前期工作,是样品制备,后期生物信息处理还得请教高博。:)
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applebook=213[使用道具]
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另外,有两个样品,要比较是用乙酰化标记好还是用ICAT标记呢或者iTRAQ?也要考虑到后期数据处理的方便。当然标记效率也要求高的方案
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yonger[使用道具]
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我的理解是LTQ-MS/MS和FT-LTQ-MS/MS检测敏感度是一样的,SDS-FT-LTQ-MS/MS是指1D SDS PAGE + FT-LTQ-MS/MS? 我们没有做过2D LC + LTQ-MS/MS和1D SDS + FT-LTQ-MS/MS 直接比较, 但从别的报告看着两种方法检测效率差不多( 如果是分成相同的等分的情况下)。我们使用的1D SDS + LTQ-MS/MS 的方法蛋白上样量是200 ug左右, 大概能发现1500-2000个蛋白左右,信号分子和受体丰度低,发现的比例很少。蛋白量少发现的蛋白会少, 我推测30ug应该可以发现500-1000左右的蛋白的。
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yonger[使用道具]
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iTRAQ 好。
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applebook=213[使用道具]
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I am very appreciated for your reply. You are just a well establised example for me! A paper in the Journal of Nature Medicine requires much and much hardwork. So what I want to do is work work and work. Try my best and make fully of myself!
Because the sample is hard to get, It would be better to choose in-solution digestion and then the sample run directly on the SCX-RPLC-LTQ-MS/MS or SCX-RPLC-LTQ-FT-MS/MS. However, without prefraction(SDS or IEF-SDS) maybe only a small number of proteins would be indentified.
In theory, FT is more sensitive than LTQ, isn't it?
It's so sad that I have been preparing for my sample for months!
We can communicate sometime.
iTRAQ对质谱仪有什么特殊要求吗?有相关的生物信息处理软件吧。这iTRAQ标记技术不是很成熟,效率可能不如乙酰化。在这只在标准样品做过,复杂样品没人做,我的样品将会很宝贵,所以正在考虑。
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yonger[使用道具]
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LTQ-FT 和 LTQ Orbitrap 都是基于LTQ的杂交产品, 理论上讲LCQ, LTQ, LXQ一类的质谱的敏感度取决于机器的扫描速度, 就是每秒能做几次MS, MSn分析,分析的次数越多敏感度越高。基于高的mass accuracy的FT和Orbitrap可以使exclusion更精确, 应该可以提高一些灵敏度, 但是一部分离子用于FT或Orbitrap, 不知道这样是不是会降低灵敏度。我没有仔细查询资料, 所以也不是非常清楚它们在灵敏度方面的差别, 但是如果有FT-LTQ, 当然是使用FT-LTQ了。
iTRAQ对质谱仪有特殊要求, LTQ不行, 需要LTQ XL, 或LTQ Orbitrap XL.
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