【求助】如何分离蛋白单体和二聚体?

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标题:【求助】如何分离蛋白单体和二聚体?

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-2-28 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我使用NI亲和层析可得到比较纯的蛋白单体和二聚体,二聚体大小为60KD,单体30KD，我们的目的蛋白为二聚体。请教分离蛋白单体和二聚体可以从哪些性质入手，采用什么方法（如考虑大小的区别，采用凝胶分离等等）？

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-2-28 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 一定pH下，电荷差异，采用离子交换层析
2 疏水性差异，采用疏水色谱
3 分子量大小或空间构型差异，采用分子排阻色谱。
如果样品量不是很大的话，个人建议采用superdex75 柱一试。

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-2-28 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢．主要是单体和二聚体的性质比较接近，我们也采用了离子交换层析纯化，但是始终无法得到纯的二聚体．由于没有纯的蛋白，目前无法测得等电点．

ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-2-28 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果是聚合体和单体通过离子交换和疏水是怕难分离的,过凝胶柱子也许是比较好的方法,有条件可以过HPLC的凝胶柱或凝胶预装柱,还可以选择分离范围小于8万的高分辨率的填料,superdex75 柱也不错.如果实在都没条件,那只能试试葡聚糖凝胶G75.

kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-2-28 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

直接通过SUPERDEX g75就可以解决问题

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-2-28 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们也做过分子筛，superdex75对大于７０ＫＤ的蛋白就不能分辨了，我们也有一些杂在７０ＫＤ处（SDS-PAGE检测不明显, 主要是单体和二聚体, >80%, 但是在做非变性电泳时能看到很多条带并且没有哪条带十分显著, 都无法判断二聚体和单体, 是否是蛋白构象影响蛋白电泳迁移?）, 如果用superdex200, 好像分辨率又不够.

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-2-28 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分子筛纯化的蛋白量很少, 不能满足做动物试验的需要, 不知道还有没有其他的方法?

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-2-28 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是聚合体不能仅看分子量,有条件最好能做WB,这样好确定,如果你已经鉴定确实是,那你可以选择superdex200,其实你大不了多次分离,只要效果好就好,如果是预装柱可以试试.不过我觉得如果是杂带,最好能倒回亲和柱做仔细分离,尽量做的纯点,这样避免后面的麻烦.

tuuu2[使用道具]
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