【求助】湿转的条件和丽春红染色

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标题:【求助】湿转的条件和丽春红染色

uaubc[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做western很郁闷，跑胶考染蛋白很明显，然后湿转300mA1.5h，可以看到最底下一条预染marker（18kd），丽春红染色膜是白的。请问一下湿转的条件到底是多少？我看过帖子里写电流乘以时间为400到500，但很多帖子也没有这样做。还有我曾经试过30ma湿转过夜，还是没有，但是在紧靠负极的滤纸外侧（靠近海绵侧）有非常明显的黄色较宽条带，而且也是分泳道的，用丽春红染膜也没有条带，连着两次都这样，做得action42kd，转膜液每次新配。按理说没有这么难呀！！另外谁知道丽春红染色的具体步骤，是不是染色出了问题？谢谢！

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

立春红染色非常简单啊，染3~5分钟，水冲就可以看到条带了。感觉你是转膜没有转上去没有，你的转膜液配方是什么？

c86v[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是转膜转反啦？

guagua[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我刚做时也有用丽春红染5分无粉色条带的，后来试着染了30分钟看还是有的，你可以适当延长染色时间

vcve[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转膜液的配方是Tris5.8g，Glycine'2.9g，SDS0.37g，应该没错，顺序是负极，海绵，两层滤纸，胶，膜，两层滤纸，海绵正极。

vcve[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有200ml甲醇

66小飞侠[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

说下我以前做的湿转，之前做的蛋白是30kD左右的。
transfer buffer： Tris 2.25g Glycine 14.4g methanol 150ml ddH20 to 1000ml
然后是横流200mA 2h。
丽春红染色应该没有什么问题吧。
如果你还是做不出来的话，那么我建议你用一下预染的蛋白Marker。这个比较简单，就是用来摸条件的。染过去的话，在膜上直接可以看到颜色的。如果没转过去，在胶里也能直接看到。如果不用预染的Marker的话，也可以把你转膜过后的胶再进行考染，看看到底有没有转过去。另外，你怕转过头的话，也可以加两层膜，这个是伯乐蛋白印记手册上写的。希望对你有所帮助。

uaubc[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问题找到了，今天早晨剪膜的时候发现外层的保护纸有点皱巴巴的，猜想可能是被水浸到了又干了，于是裁掉，再转膜就好了，还有一个疑问，转好的膜放在去离子水里一洗就出现条带了，根本不用丽春红染。还有就是预染的marker小分子量转的很漂亮，颜色也上去了，但是大分子量的颜色转不上去，而样品正好相反，大分子量很明显，小分子量看不清，这又是怎么回事？

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发表于 2014-3-1 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 uaubc 于 2014-3-1 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
问题找到了，今天早晨剪膜的时候发现外层的保护纸有点皱巴巴的，猜想可能是被水浸到了又干了，于是裁掉，再转膜就好了，还有一个疑问，转好的膜放在去离子水里一洗就出现条带了，根本不用丽春红染。还有就是预染的marker小分子量转 ...

【1】这是个正常现象，但是注意到的人好像并不多，或者说引起重视的好像并不多。其实条带能不能转到膜上（至少PVDF膜是这样），根本就不用丽春红染色的。转完膜，放在滤纸上晾干，这时候仔细观察，会发现出现条带，但是时间很短，没有蛋白条带的地方先干，变白，而有蛋白条带的地方就显出了条带。但是这时间很短的，过一会儿，条带也干了，整个膜就变的一样了。同样，把干了的膜放到水里或者放到甲醇里也会出现条带，这个的时间更短，要注意观察。感觉这个的敏感度比丽春红要差一些的，但是丽春红染色有时候的效果并不是很好。产生上述结果的原因也简单，就是膜上有了蛋白条带之后变干或者变湿的时间和没有蛋白的地方产生了差别，就出现了上述现象。为了证明确实是蛋白条带。我曾经做过几次实验。就是把膜纵向（沿着泳道）剪开，一部分用丽春红染色，一部分不用丽春红染色。结果两者的条带位置是一致的。
【2】你的第二个问题是这样的。MARKER转膜的效果主要跟膜的孔径和转膜时间（转膜电流）有关的。膜的孔径小的话，小分子量的容易转上（其实大小分子量的都更清楚一些）。在同样的时间和电流的情况下（而且同样的转移液），小分子量的蛋白转膜的时间要短一些，大分子量的转膜时间要长一些。
你说目的蛋白大分子量的蛋白条带清楚，主要是有些大分子量的蛋白含量比较大（远大于小分子量的一些蛋白），而且和膜的结合力也很强，所以看到的是目的条带的大分子量蛋白。

66小飞侠[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2014-3-1 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

【1】这是个正常现象，但是注意到的人好像并不多，或者说引起重视的好像并不多。其实条带能不能转到膜上（至少PVDF膜是这样），根本就不用丽春红染色的。转完膜，放在滤纸上晾干，这时候仔细观察，会发现出现条带，但是时间很短，没有 ...

我没有在去离子水里浸泡过，如果你早半天发的话，我想我会试试的。另外你说大分子量的没有转上去，这个也是正常的，你可以延长你的转膜时间。不过小分子就有可能会透膜而出。所以你应该根据自己的目的蛋白的分子量，选择合适的转膜时间。