【求助】蛋白表达,未诱导和诱导组之间没差异?

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标题:【求助】蛋白表达,未诱导和诱导组之间没差异?

docsy[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位老师,小弟最近在做一个蛋白在大肠杆菌中的异源表达.之前在载体构建上都没有问题,已经到最后一步了,但就是这最后一步要我老命了!怎么都诱导不出来,我是这样诱导的:
将准备诱导的菌摇到OD=0.8左右,分成两管，其中一管加入终浓度为1mM的IPTG，于37度下，250rpm诱导4个小时，另一管作为对照。
时间到后，各取1mL菌液，12000rpm离心，加入400uL 1%的SDS将菌液悬浮，在100度下沸水浴10min，再12000rpm离心，取上清作为蛋白质样品作SDS-PAGE分析。结果靠马斯亮蓝染色发现，对照和诱导之间几乎完全没有差异（目的条带：蛋白+载体= 63 KD，在66KD附近都有条带）。然后我又试了不同诱导时间，结果还是没有什么差异。请教各位老师，这是什么原因造成的？
我怀疑是稀有密码子导致蛋白未表达，在cuturl('http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/')进行稀有密码子分析后发现了18个稀有密码子，但都没有成串，应该不会对蛋白表达产生致命的影响。所以小弟很迷惑！恳请高手赐教！

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人也同样遇到这个问题,困惑中,但在后面的免疫印迹中,有条带出现,所以没在意,可是在蛋白纯化时,HIS柱无论如何挂不上,找不出原因.

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顶，我也一样，是不是IPTG不诱导也有蛋白表达

ending[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

诱导后不表达的原因实在是太多了。诸多方面的问题需要考虑。首先，诱导之前有没有对表达载体进行酶切鉴定和测序以确定载体的万无一失呢？第二，有没有进行严格的无菌操作以确定没有无质粒杂菌引入呢？第三，是不是因为表达量过少条带太细小而与阴性对照无法分辨呢？仔细想想自己的存在的漏洞后，也许就表达了。

remenb[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你怀疑是稀有密码子，那就用ROSETTA菌表达一下试试。但是并不一定构建没有问题，诱导的手段也没有问题就可以诱导成功。或许你可以试试低温诱导，或者诱导时间长一点，做一个IPTG浓度梯度看看。如果这些都试过，或许他根本不表达，或者表达量很低看不到。我做过100多个蛋白，成功率也只有70%。并不保证每个蛋白都能表达成功。实在不行换换载体和宿主细胞或者换一种系统。

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得也有可能是电泳时上样量太少了。所以看不出差别。。
我们实验室是诱导后取样0.5mL,离心，加50 uL 水+50 uL loading buffer,煮10min,离心，取10 uL上清直接上样。有没有表达一般都能很明显的看出来，对于楼主的情况，好像比我们的方法稀释倍数大了很多，如果表达量不很高的话，有可能看不出差别。
如果加大上样量还是没差别，那就真的有可能是不表达了。

caihong[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

将准备诱导的菌摇到OD=0.8左右，这个OD太高了，都快老死了，OD＝0.6左右比较好

docsy[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位的宝贵建议！我今天又做了下，把诱导前的OD提高到了1.5左右，采用了TB和LB两种培养基，并且将AMP的浓度提高到150ug/ml，诱导时间分别取了2h,5h。结果今天跑电泳发现有差别的条带，不过分子量要比我预计的小。预计的（蛋白+载体）63kD,跑出来的差别条带为43kD左右，而63kD处并没有明显的条带。这个是个什么问题呢？读码框移位了？还是稀有密码子提前终止了翻译！

NBA[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 docsy 于 2014-3-1 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢各位的宝贵建议！我今天又做了下，把诱导前的OD提高到了1.5左右，采用了TB和LB两种培养基，并且将AMP的浓度提高到150ug/ml，诱导时间分别取了2h,5h。结果今天跑电泳发现有差别的条带，不过分子量要比我预计的小。预计的（蛋白 ...

你把蛋白序列发上来看看好了

docsy[使用道具]
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发表于 2014-3-1 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2014-3-1 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你把蛋白序列发上来看看好了

这是转化入BL-21（DE plys）前质粒测序结果：
AAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCTCATCAACAAACCGCGCTGCAATGGCAATCCTCACATCATGTTGGTGTATCGACCTTGGCATCATATTAATTGGCGCCTTCATAGGCATATATAGTTTCTATCAAAAAAAATTCAAACACTGGAAAAAATACAATATTCCGCATTCGAAGCCGAAATTTCCGTTCGGTGATTTAATAAGCATCACCACCATGGGTGAAAATTTCGTTTTAACTTTGGATCGAATTTATAAATCATTTGAGAAGGAAAAAGTCGGCGGCATATGGGCATTTTTTCATCCTATTTTGATAGTGAGAGACGTCGAAGTTATAAAGGATATCCTTGTAAAAGAATTTATGAGTTTCCACGACCGTGGAGTACCGGTCGACGAGAAAAATGATCCTTTATCAGCACATCTTTTTTCGATTAGCGGATCGAAATGGAGGAATTTAAGAGCAAAATTAACCCCAACATTCACATCTGGAAAAATGAAAATGATGTTCCCGATTTTGGTGGAATCTGGCCGTGAAATGATCAGCATTTTGGAGCCGAATGCAATTAATAAAGACATCGTGGAAATGAAAGATATTTTAGCCAGATTTACGACGGATGTAATAGCATCCTGCGCTTTCGGGATCGACAGTAATTCATTAAAAAATCCAGATACCGAGTTTCGGAAAATGGGGAGAAAAATCGTGGAGCCATCCTTCGCAAATATTTTGAGGAATTTCTCTTTCATGGCAATGCCTACGTTGGTTAAAATATTTAAGATTAAATTAATCCCGGAGTATTTGGCTAACTTCTTCATGGGTTCTGTTCGAGAAACGATGGACTACAGAGAACAAAATAATGTGAAACGAAATGATTTTATGCAACTTTTGATCCAATTGAAAAACAAAGGAAAATTAGACGATGTCGACGAAATAAAGGAAAAAACGGATGATGGAAATGAAATCAAAGAACTGGAGGTGGAGGAAAATAGAAGCGATCAAAAATTTTCCTTCGAGGAAGCAGCCGCCCAAGCGTTTATATTCTTCGTCGCCGGGTTTGAAACGTCCTCAACAACAATGGTCCTCGCGTTATACGAACTAGCTTTACAGCCTGAGATCCAAGAAAAAGTAAGGAATGAAATTAAAACAGTTTTGGGAAAGCACAACGGAAAAATCACGTACGAAGCAGCATTCGGAATGGATTATTTAGGAAATGTTATCGATGAAACTCTGAGAAAATACCCAGTGGCAGGAGTAATAATTAGGCAATGTAATAAAGACTATAAAATTCCGGATAGCGATATGGTGATTCCCAAAGGAACTTCTACGCATATACCGATTTATTCCCTTCATTACGATTCAAAGTATTTTCCGAATCCTGAGAAATTTGATCCGGATCGTTTCACAGAAGAAGTCAAATCTCAACGTCCTCGTTATGCATATTTACCGTTCGGAGAAGGGCCAAGACATTGCATTGGCATGAGATTTGGACTAATGCAAACCAGAGTAGGACTAATAGAATTATTACTAAATTATAAATTTGAGATTTGCGAAAAGTCACCAGTGCCCCTGAAATTCAGTAGCATGTCATTCACGCCCAAAGAAGGCATGCATCTAAGGTTATCAAAAGTGAATTGA
蛋白序列：
AAAPFTSSTNRAAMAILTSCWCIDLGIILIGAFIGIYSFYQKKFKHWKKYNIPHSKPKFPFGDLISITTMGENFVLTLDRIYKSFEKEKVGGIWAFFHPILIVRDVEVIKDILVKEFMSFHDRGVPVDEKNDPLSAHLFSISGSKWRNLRAKLTPTFTSGKMKMMFPILVESGREMISILEPNAINKDIVEMKDILARFTTDVIASCAFGIDSNSLKNPDTEFRKMGRKIVEPSFANILRNFSFMAMPTLVKIFKIKLIPEYLANFFMGSVRE***YREQNNVKRNDFMQLLIQLKNKGKLDDVDEIKEKTDDGNEIKELEVEENRSDQKFSFEEAAAQAFIFFVAGFETSSTTMVLALYELALQPEIQEKVRNEIKTVLGKHNGKITYEAAFGMDYLGNVIDETLRKYPVAGVIIRQCNKDYKIPDSDMVIPKGTSTHIPIYSLHYDSKYFPNPEKFDPDRFTEEVKSQRPRYAYLPFGEGPRHCIGMRFGLMQTRVGLIELLLNYKFEICEKSPVPLKFSSMSFTPKEGMHLRLSKVN
测序显示读框没有问题啊！为什么就只有40多kD呢？

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