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标题:【求助】急请各位高手分析下我的2DE图为什么上半部分...

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2014-3-1 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】急请各位高手分析下我的2DE图为什么上半部分...

我用的是PH4-7的胶条，以前跑的图只是酸性端有一团糊糊的东西，这次整个上半部分都是，不知道这是什么东西？会不会是核酸呢？标本是角膜组织，本身有少许的血液污染。


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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2014-3-1 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下面这张是和上面那张同时跑的胶，酸性端一大片糊糊的。两个样本分别是我的实验组和对照组，都是采用同样的处理方法，上样量都是230微克，聚焦参数参考BIORAD的方法。为什么差异这么大呢？非常希望得到各位的分析和指导。谢谢


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发表于 2014-3-1 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以前我也遇到过这种情况，有两种可能的原因，1，电泳缓冲液ph值是不是达到要求，最好是新配的，2染色温度的原因。不知道你的二向是不是跑的sdspage还是tricinesdspoage?
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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-3-1 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得有可能是核酸的问题。不知道样品有没有经过超声处理，可以试一下。血液污染应该与这个无关，我做的组织混有很多血液，不会出现这种情况
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发表于 2014-3-1 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
.我的二向跑的是SDS-PAGE,染色方法用的是银染,和实验室的其它同事用的是相同的电泳缓冲液的染色温度,他们却没有遇到这种问题.楼上提到的超声是用超声细胞破碎仪吗?我没有用,不知道eyedrop用的超声强度是多大，匀多久呢？
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发表于 2014-3-1 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，你们觉得有必要使用DNAse1 和 RNAse A吗？
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2014-3-1 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的胶条是17cm的，请问DIGE如果用100－150G的上样量，点会不会很浅。另外，你在用TCA-丙酮纯化蛋白的时候，会不会遇到沉淀难溶的情况呢？
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发表于 2014-3-1 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问一下，用超声的方法去除核酸，具体的步骤应该是怎样的呢？
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发表于 2014-3-1 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的胶条是17cm的，请问DIGE如果用100－150G的上样量，点会不会很浅。另外，你在用TCA-丙酮纯化蛋白的时候，会不会遇到沉淀难溶的情况呢？

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刚开始做时，我也是200ug上样，银染后，点虽多，但背景太高，没法分析。
丙酮纯化后确实有难溶的现象。而且跑的图谱不太好.
后来我用了GE的clean up试剂盒，同时我用的是80ug上样，结果还可以。
给你贴一张我的2DE图，供参考。


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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2014-3-1 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想再请教您，您的前后两张图除了使用CLEAN UP KIT以外，聚焦参数等条件有改变吗？我一向聚焦的时候总伏时数大约10万，会不会太多了啊？以至横纹特别明显。我觉得你的第二张图的横纹现象改善的很好，想请教您是怎么改进的。
我没有用过CLEAN UP KIT，在这里问个弱弱的问题，就是CLEAN UP KIT的主要作用不是针对除盐吗？它为什么对去背景效果也这么好呢？
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