【求助】wb目的蛋白和内参（beta-actin）都没有曝出...

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】wb目的蛋白和内参（beta-actin）都没有曝出...

12 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】wb目的蛋白和内参（beta-actin）都没有曝出...

nvdabing[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108897
精华 0
积分 252
帖子 204
信誉分 100
可用分 1787
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2014-3-1 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做了几次磷酸化蛋白的western,目的蛋白和内参（beta-actin）都没有曝出！极受打击...
我用ripa裂解液提的细胞蛋白，裂解液中加了酶抑制剂，蛋白浓度测定在4~12ug/ul，上样量调整到60ug/孔。样品是加了上样缓冲液煮沸后保存在-80度，分装，不超过两周，一次用一支。
电泳条件：浓缩胶60V，12%的分离胶100V。
转膜条件：冰上，300ma湿转，90min。（蛋白分子量在40~54）
转膜后膜上可看到彩色的marker。
含5%脱脂牛奶的TBST，室温封闭1h-->TBST洗膜5min,3次（cst一抗的依说明书）-->一抗（p-jnk,1:2000，actin1:1000）稀释液为含5%BSA的TBST，4°摇床过夜-->TBST洗膜10min，3次-->二抗1:1000室温1h-->TBST洗膜10min，3次-->ECL发光。
想不出操作有什么问题，同样的蛋白第一次做的时候目的条带很浓，内参也很浓，甚至曝光完之后在膜上都能看到隐约的条带。但只是第二天，相同的条件，目的蛋白换了，连内参都没有出来！后来以为蛋白降解了，重新提了蛋白，还是做不出来。
恳请大家给些意见！

hulu呼噜[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77048
精华 0
积分 298
帖子 275
信誉分 100
可用分 2196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2014-3-1 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对楼主的操作，我觉得：
1，在封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST）封闭非特异性反应和孵一抗之间，没有必要洗膜。
2，蛋白上样量多少微升？？，不应低于20微升。你测的是总蛋白浓度，它不能反映目的蛋白的浓度。
下一步楼主可以用丽春红染膜看看蛋白转的情况（膜上有没有自己想要的条带），如果有，问题就处在后面步骤
1，发光液是否过期？
2，转上蛋白的膜的那一面为“上面”，在孵一抗二抗的时候最好“上面”朝上，在摇床上洗膜的时候更应该是“上面”朝上，避免摇床的时候吧膜上的蛋白摩擦掉；用发光液处理的时候，保证发光液充分处理“上面”；在曝光的时候，保证“上面”朝上
3，曝光时间可以适当延长
4，楼主用的是pvdf膜？？pvdf膜是否用甲醇活化过？？
5，一抗二抗之间的浓度需要摸索最佳搭配----说明书一般都给出一个范围，具体的还需要自己摸索（我就是自己摸索的）-----因为免疫反应是按比例的，抗原和抗体的比例不合适也难出结果。
希望楼主把后续的试验及时反馈，一起讨论共同提高，愿我能带给你帮助！

nvdabing[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108897
精华 0
积分 252
帖子 204
信誉分 100
可用分 1787
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2014-3-1 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢楼上的意见。
在封闭后洗膜这一步确实可以省去，只是当时按照一抗说明书操作了；蛋白上样量在50-60ug，我0.75mm的梳子每个孔最多上20ul。我想这个浓度怎么说内参都够了呀。
转膜后在膜上可以清晰见到预染marker，之前这么转也成功过，所以我觉得应该没有问题...
1.今天换了别人的发光液，GE的，内参还是没有曝光出来
2.操作过程中一直是把蛋白面向上，也剪了角标记，应该没错
3.曝光时间延长到什么程度？我记得以前内参一眨眼功夫就出来了。。
4.是pvdf膜，先在甲醇里浸润了一会
5.说明书上一抗（cst）浓度给了1：2000，内参1：1000，具体摸索没有仔细做，因为总觉得内参以前就是这样很好做出来呀
今天又做了一次，两块板，一张做内参，一张做目的蛋白，结果曝光出来的都是大白板，连膜都看不到，但是大概曝光到4、5分钟后，transform调整了一下可以看到目的条带的膜（如下），内参的还没有看到......不知道这样的像这样的是什么问题？

附件

2014-3-1 17:44

93919173.jpg (4.84 KB)

jujuba[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79697
精华 0
积分 612
帖子 903
信誉分 100
可用分 5331
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态离线

发表于 2014-3-1 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

操作的问题吧，要不拿过来我们给你做做

nvdabing[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108897
精华 0
积分 252
帖子 204
信誉分 100
可用分 1787
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2014-3-1 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

操作哪部份的问题呢？楼上的你是哪的？

standbyme[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75190
精华 1
积分 365
帖子 405
信誉分 102
可用分 2821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2014-3-1 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

吉尔生化，建议你拿到一个western 做的没问题的实验室去做做看。

hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2014-3-1 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在我的考虑：假设你的蛋白提取没有问题，
1，电泳液电转液等液体都重新配置，调整好ph，认真的按部就班从头到尾的在做一次
2，电泳结束后去一部分胶做考马斯亮蓝染色，看看有没有目的条带和内参条带
3，转膜后，对转膜后的胶做考马斯亮蓝染色看转膜是否彻底，对膜进行丽春红染色看看目的蛋白和内参是否转上。然后再用洗脱液洗净就可以继续下面的步骤。
4，加二抗时内参的二抗和目的基因的二抗不要加错。
请及时反馈试验进展，看看问题处在哪里，祝好运！

avi317[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态离线

发表于 2014-3-1 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你把胶和膜取的大一些,marker有时候跑的并不标准,看看是不是把目的蛋白的条带剪掉了

hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2014-3-1 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上说的有道理，这个可能也存在，低级错误：）

nvdabing[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108897
精华 0
积分 252
帖子 204
信誉分 100
可用分 1787
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2014-3-1 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你把胶和膜取的大一些,marker有时候跑的并不标准,看看是不是把目的蛋白的条带剪掉了

==================================================================

maker不准的话误差会很大么？晕了，我一般在目的蛋白maker位置上下大概10kd左右

12 1/2 1 2 ››