【求助】蛋白纯化-这个蛋白真是很难搞定！

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标题:【求助】蛋白纯化-这个蛋白真是很难搞定！

daod[使用道具]
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发表于 2014-3-3 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友，我正在做一个蛋白的纯化，其预测等电点pI 8.6左右，有二硫键，在纯化过程中有如下的情况：
1、采用GE介质SP-FF纯化
2、过柱纯化条件：20mM PB8.0+20mM DTT+0.1M NaCl平衡层析柱，然后0.3/0.5/1.0M NaCl进行阶梯洗脱，全程都有目的蛋白，而且穿透明显。如图
3、曾经采用降低pH至6.5、7.0、7.5，基本在SP-FF全部穿透，较pH8.0更甚
怀疑：
1、蛋白状态不是很均一？导致全程都有目的蛋白洗脱，得率偏差
2、核酸-蛋白复合物影响？导致全程都有目的蛋白洗脱
求助：
1、如何减少穿透？如何将0.3M NaCl洗脱组分的目的蛋白向后移，提高总得率。因为如果将0.3M NaCl所有的组分全部混入0.5M/1.0M，后期纯化很难，因此只想将目的蛋白后移就行。

附件

2014-3-3 10:55

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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-3-3 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

平衡液的电导是不是比较高？我过离子柱一般用Tris-HCl 10mM左右，不加盐平衡柱子。

daod[使用道具]
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发表于 2014-3-3 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

电导确实稍微高点，12ms/cm左右，因为涉及到工艺方面的简化，不想引入交换缓冲液等步骤，另外，我个人认为与上柱前的电导关系不是很大，因为我的部分蛋白还是与层析柱结合很紧密的，所以仍然考虑与状态的不同有关

JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-3-3 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

据我的经验，分段经验有可能会有在各个盐浓度下都有蛋白出来，最好用梯度洗脱，可能就会没有这种情况，你的还好了，我的蛋白pI与你一样，我从pH6.0试到8.5，极少部分挂柱，大部分都穿出，不知道大家能不能帮我分析一下原因，谢谢了

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发表于 2014-3-3 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

据我的经验，分段经验有可能会有在各个盐浓度下都有蛋白出来，最好用梯度洗脱，可能就会没有这种情况，你的还好了，我的蛋白pI与你一样，我从pH6.0试到8.5，极少部分挂柱，大部分都穿出，不知道大家能不能帮我分析一下原因，谢谢了

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等电点测的准确么？

daod[使用道具]
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发表于 2014-3-3 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我所采用的就是阶梯洗脱，我本人一直认为蛋白的状态不同与层析柱的结合情况也会不同。而且我们这个蛋白有点违背常规：即并不是越偏离等电点(低于等电点)越多结合就越紧，反而是偏离越多，穿透越多，靠近等电点反而会结合较紧密！但不管怎样？穿透量大和全程都有目的蛋白的问题一直困扰着目前的实验。请各位战友积极参与讨论！

yes4[使用道具]
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发表于 2014-3-3 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的建议：
1、在开发工艺的时候，先不要怕麻烦，先脱盐尝试看看，有时候盐浓度影响挺大的。
2、填料的体积可以适当多一些，如果蛋白过载，也会有类似的情况
3、可以尝试添加一些非离子去污剂，减少蛋白之间的相互作用，从而影响蛋白的电荷
顺便问一下，是什么蛋白，其实了解蛋白的背景很重要。

star#room[使用道具]
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发表于 2014-3-3 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的等电点没有测，是软件预测的，而且我的和楼上情况很类似，偏离等电点越远约结合不上，靠近了还能结合上点，不过也很少

daod[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用的是GE的sp FF是预装柱还是自己装的，目前我也在用这种填料，问题很多。~~~~