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标题:【求助】his-tag标签蛋白纯化

bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】his-tag标签蛋白纯化


请教his-tag标签蛋白纯化：
我用的是酵母表达的蛋白，带有his－tag，用的是Novagen公司的镍柱纯化试剂盒，buffer是试剂盒带的，镍柱需要自己做，我按照试剂盒说明操作，但是每次镍柱总是堵塞，而且在wash buffer和bind buffer都有目的条带，而elution buffer很少，且有杂带。请教高手指导！谢谢！！！
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也许你蛋白容易沉淀才会堵，样品一定要过滤，此外可以参考别的公司的说明书自己配缓冲液试试．
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bangqi_k[使用道具]
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 小中大

我在过镍柱时，有沉淀在柱子上，是不是把样品稀释一下也行啊？
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gogo[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您的蛋白是从分泌表达的吧,镍柱纯化的话,最好在纯化前先把酵母液透析,去除一些色素及其他杂质.
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bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白之安基：您好！
谢谢您的建议！我还有以下问题需要请教：
我的蛋白是酵母分泌表达的上清经硫酸氨沉淀得到的，然后透析，这样上镍拄时还是有沉淀睹塞柱子。您的建议是直接把酵母上清透析，我尝试一下。还有人建议我过滤后再上柱，请问怎么过滤，用什么过滤？
谢谢！期待您的回复！
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

0.22um或者0.45的过滤器就可以
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gogo[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白之安基：您好！
谢谢您的建议！我还有以下问题需要请教：
我的蛋白是酵母分泌表达的上清经硫酸氨沉淀得到的，然后透析，这样上镍拄时还是有沉淀睹塞柱子。您的建议是直接把酵母上清透析，我尝试一下。还有人建议我过滤后再上柱，请问怎么过滤，用什么过滤？
谢谢！期待您的回复！
......

===============================================================================================================

您的蛋白经硫酸氨沉淀得到的,透析后就不需要我那个步骤了,那可能是您的目的蛋白不稳定或别的原因,容易沉淀在柱子上啊,您有没有跑您的柱子啊,看是什么沉淀在上面,是你的目的蛋白还是别的.
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bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问各位朋友：你们好！
感谢各位的建议！
我还想知道，上镍柱之前，样品用0.22或0.45um过滤器过滤，还有朋友说告诉离心，这样会不会把目的蛋白滤除呢？谢谢各位！！！
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bangqi_k 于 2014-3-3 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问各位朋友：你们好！
感谢各位的建议！
我还想知道，上镍柱之前，样品用0.22或0.45um过滤器过滤，还有朋友说告诉离心，这样会不会把目的蛋白滤除呢？谢谢各位！！！ ...

不会，除非你蛋白不溶解是沉淀
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bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-3-3 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！
谢谢您的建议。
我用0.22um的滤器过滤时一下就堵塞了，还是用高速离心会不会效果好一些呢？我着急的不行了，拖了很长时间了，谢谢您的帮助！
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