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标题:【求助】怎么尽量避免蛋白降解呢？

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎么尽量避免蛋白降解呢？


请教各位战友：我的目的蛋白是17kD，是不是小分子蛋白特别容易降解啊？那怎么避免蛋白降解呢？
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看你是做什么了，如果是western的话，在样品中加入上样缓冲之后煮沸变性，一般来说不容易降解。我做过很多分子量是10-20之间的目的蛋白，有的大概是提取蛋白后3个月才做的，都没有问题。祝好运！
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！自然是做WB的，我主要是担心取材过程有没有什么操作不当而每考虑到的地方！我的标本小，每次要攒十个才够制一次样，冰上操作，每个也就2分钟，取下来我放EP小管中插在冰里·，但总时间有点长，那周还赶上节能周，手术室温度很高，冰化得快，都是冰水混合物的状态，取完一起放负80度冰箱，这样会有问题么？还有我听有的老师说取材的手术器械要消毒，还要避免材料沾水，是这样么？谢谢了！
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对了还有：您做小分子的蛋白，20kD以下的，一定要用0.2um孔径的膜么？有人说0.45的也无妨，是这样么？我现在总是目标蛋白出不来，着急找原因，还望多多指教！
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于蛋白保存，建议用0.22um的膜过滤，0.22和0.45的区别在于：0.22的可以达到无菌要求，这样样本在4度也可以保存一段时间而由细菌引起的降解基本无，但是0.45的，不能保证无菌，只能除掉绝大部分颗粒，和大部分细菌及细菌碎片，还有一些小的细菌，如粘质沙雷菌等还是可以滤过的，
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我不太懂您的意思，我说的膜是指转膜时用的膜，您说的过滤是哪一步做啊？
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+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你的蛋是怎么提出来的？

是组织蛋白还是什么蛋白？
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+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zwsyrt 于 2014-3-3 15:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢！自然是做WB的，我主要是担心取材过程有没有什么操作不当而每考虑到的地方！我的标本小，每次要攒十个才够制一次样，冰上操作，每个也就2分钟，取下来我放EP小管中插在冰里·，但总时间有点长，那周还赶上节能周，手术室温度很高，冰 ...

是组织蛋白？
直接取样后放-80
在液氮中研碎
离心
上清中就有蛋白
取样的手术器材没有你说的那么小心，一般操作都可以了
当然我们取耗子心脏，可能不一样
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49888[使用道具]
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发表于 2014-3-3 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以加入Protease inhibitor: PMSF等
但组织得来的蛋白样品最好用混和的Cocktail Protease inhibitor(cocktail). sigma等公司有售. 内含多种针对不同蛋白霉的抑制剂. 如 PMSF, leupeptin, pepstatin, aprotinin等.
但提取后的蛋白样品除western用外,没有其它用途的话, 可以测完蛋白浓度后, 立即用Loading buffer处理, 变性蛋白, -20 或者-80保存. 就无需考虑蛋白降解的问题. 只在提取时保持低温, 并在裂解中加入PMSF就可以了. 关于PMSF的配制和使用方法可参照下帖:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/850655_0.html')
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33号[使用道具]
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 小中大
大孔径的膜，转的时间过长，小分子蛋白会穿膜透过去。
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