【求助】新手做CO-IP后2D电泳，遇到很多问题

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标题:【求助】新手做CO-IP后2D电泳，遇到很多问题

sistis[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道版上有没有人做过co-IP后再用所得到的蛋白做2D电泳。我最近刚刚开始做，碰到很多问题。
我考虑的是要做2D，首先我必须得到我的目的蛋白，这样我才能研究他的相关蛋白。图一是我做的预实验，我用抗目的蛋白的抗体做的CO-IP再进行了银染，发现我的目的蛋白已经沉淀了下来。这时我是用20微升的2*SDS sample buffer重悬蛋白-抗体-磁珠复合物， 100度沸水中煮5min后上样的进行电泳的。
于是我就想做一下用2D的裂解液（8M Urea,4%CHAPS,2%pharmalyte3-10,40mM Tris)重悬蛋白-抗体-磁珠复合物后上样，因为我师姐尿素在高温下会分解和蛋白形成加合物，从而影响后续的检测。但是做了之后的结果让我很意外（图二）。
我发现我的目的带不见了，原先的免疫球蛋白的重链也不见了，取而代之的是在100KD左右的地方出现了一条很浓重的带。不知道版上有没有人遇到过跟我一样的情况，或者有经验的前辈能不能给我指教一下。
如果版上有人做过co-ip/2D的实验，能不能给我讲讲经验，不胜感激。

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2014-3-3 16:31

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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问你的CO-IP的材料是做的社么，反应的条件是什么呀？

glass[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我很久前做过。
免疫共沉淀产物用1D SDS胶就很好了， 2D的目的是为了分离复杂蛋白成分，你的图1已经可以看到差异就没有必要作 2D了。从图1 至少可以看到4-5个差异条带。
如果因为质谱条件限制，必须 2D, 2D裂解条件要适当改变，因为2D裂解液没有1D SDS 裂解强烈，所以很多蛋白复合物不能分开，你的图2大概是抗体二硫键没有打开，抗原抗体复合物也没有分开造成。我当时是加温和加少量SDS增加变性能力，（温度42还是50几度我忘记了， SDS浓度也不确定，你用Google 应该可以查到）。免疫沉淀物先SDS 变性，然后纯化会损失很多，不建议使用。
另外我们的经验，银染后质谱监测效率比考染差多了，所以最好不用银染，如果有条件可以将整个条带切成小胶条，每条都作质谱，可以发现考染看不到的蛋白。
good luck!

sistis[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我CO-IP的条件一般是蛋白加入抗体后室温孵育两个小时，然后在加入proteinG(25%slurry)4度过夜。用的裂解液是（trionx-100/PBS)

sistis[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我CO-IP的条件一般是蛋白加入抗体后室温孵育两个小时，然后在加入proteinG(25%slurry)4度过夜。用的裂解液是（trionx-100/PBS)

ero11[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我找到原来试验纪录，我这样做的：
1， TritonX 100 lysis buffer，离心10，000rpm x 30 min，supernate。
2, 1ST antibody, 4C rocked overnight， or 4hr.
3,离心 10，000rpm x 30 min，supernate。(tricky step!!)
4, add Protein A/G 4C 1hr. （2 Hr is OK)
5，wash lysis buffer X 3, PBS X 1
6, cold acetone X 3
7, rehydration buffer 270 ul
8, sonicate 5 min
9, rocked 1 hr, 离心

sistis[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问一下你的trionx-100 lysis buffer的具体配方是什么？
第三步中为什么要这么高速的离心？会不会破坏蛋白与蛋白和蛋白与抗体间的相互作用？
第六步是用冷丙酮沉淀吗？我的蛋白量很少，会不会沉淀不下来啊？
第八步超声是带着beats 超声的么？具体的工作强度是多少？
不好意思问了这么多问题，希望前辈能给我些指导

hustwb[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第3步是将细胞膜和不溶成分去掉, 不会破坏蛋白间作用.
第六部的丙酮沉淀不是为了沉淀蛋白, 而是把beads中的盐分去掉,蛋白会在beads上的, 这可能是我想出来. 我用100 -200 ul 50%的beads, 这样会带有很多盐分, 影响一向聚焦.
超声是为了把蛋白从beads下游离下来, 不同的超声仪器强度不同, 原则是不要太热就可以, 那种探头式的, 10秒 3次, 中间冷却, 或在冰水中操作就可以. 容器式时间要长点, 3-5 分钟.
Lysis buffer: cuturl('http://www.biochemj.org/bj/397/0337/bj3970337.htm')