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标题:【求助】如何利用非变性电泳检测蛋白多聚体

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何利用非变性电泳检测蛋白多聚体


我的蛋白重组表达后普通PAGE跑出来有单体和二聚体两种
我现在想确定一下纯化出来的蛋白主要以什么形式存在，是二聚体还是单体
刚跑了一个非变性PAGE，结果是Marker跑不动（普通sds－PAGE　marker），只有两条带，而且一条清晰的在最头上，我的目的蛋白就更不清楚，弥散的，也分不出来分子量大小　，更不用说是不是二聚体了，
请各位指教，用什么方法可以确正蛋白存在形式呢？还有非变性电泳有合适的Marker吗，据说价格不低，其他确定分子量方法还有吗？非还原电泳与之有不同吗？
小的在此叩谢了！！
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把你现在纯化的蛋白跑个非还原ＳＤＳ－ＰＡＧＥ与之前同时含有单体和二聚体的样品一起跑，看看跟那条条带相近应该就知道是什么形式了呵！或者把纯化出来的蛋白打个质谱，这样得出的分子量应该更直接证明存在形式。
如果跑非变性电泳，可以跑个不同浓度的连续非变性胶，迁移率与胶的浓度有个对应关系，根据那个也可以计算出分子量（这种方法比较麻烦，好像只在几十年前的文献中出现过）。
上样缓冲中加还原剂的是还原电泳，不加还原剂的是非还原电泳；配胶中加ＳＤＳ的是变性电泳，不加ＳＤＳ的是非变性电泳。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有没有条件用个分析分子凝胶柱跑一下？analytic gel filtration column
打质谱有没有可能把多聚体打掉成单体了？
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bring[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. Gel filtration
2. 同时跑一个长时间煮沸的样（这时候应该成单体了），同时跑不煮的样。Native PAGE。不过不能告诉你是dimer还是trimer，tetramer。。。
3. 有Native page的marker卖吧？不过没用过，不知道。
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也很想知道~我们遇到相同的问题了,我SDS-PAGE是两条带
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
打质谱有没有可能把多聚体打掉成单体了？？

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质谱好像有的时候能把因二硫键而形成的多聚体打成单体，有的时候打不断，这个与激发强度有关。
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有抗体吗？
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张先生[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2. 同时跑一个长时间煮沸的样（这时候应该成单体了），同时跑不煮的样。Native PAGE。不过不能告诉你是dimer还是trimer，tetramer。。。

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在过分子筛的时候加点marker就能大致确定分子量了，这样可以判断是trimer，tetramer。。。
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831226[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用普通sds－PAGE　marker跑非变性电泳当然是两条带了，因为普通sds－PAGE　marker也是需要裂解的，还需要sds，而非变性电泳缓冲液和胶中都没有sds，所以你跑不出预期的效果。至于有没有卖非变性PAGE　marker的我还不知道，估计应该有吧。
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ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2014-3-3 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以跑一个分子筛!
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