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标题:【求助】溴芬蓝和目的条带相近?咋办?

qianqin1977[使用道具]
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【求助】溴芬蓝和目的条带相近?咋办?


各位战友:我要检测的是18KD的蛋白,遇到如下问题想请教一下
1.溴芬蓝和目的条带位置相近怎么弄啊?
2.跑胶的时候,浓缩胶没有将溴芬蓝浓缩成一条线,大约要指宽,是如何回事?我5%浓缩胶,分离胶是15%。
3.31KD以下的蛋白是否量很少?还是很容易降解?为什么考马斯亮蓝染色条带几乎看不到?


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1.溴芬蓝和目的条带位置相近怎么弄啊?
溴芬蓝和目的条带位置相近对结果没有影响吧,不用考虑溴芬蓝的,当你的跑好的胶在水里洗一下,如果时间就可以洗掉的。在一个溴芬蓝只是跑胶的一个指示剂,如你所说的话,你只要保证溴芬蓝不要跑出去就行了,最好离下边沿有一定距离。
所以在你染色和脱色以后胶上已经能够没有溴芬蓝了,所以不用考虑溴芬蓝的事。
2.跑胶的时候,浓缩胶没有将溴芬蓝浓缩成一条线,大约要指宽,是如何回事?我5%浓缩胶,分离胶是15%。
没有浓缩的原因很可能和你的电压或者电流有关(不同的地方有的用的是恒压有的用的是恒流)有关,楼主是不是在跑浓缩胶和分离胶的时候电压或者电流一样。
实际上应该是在浓缩胶的时候,引物聚丙烯酰胺凝胶的空隙比较大,蛋白跑的比较快,所以应该用低压或者低流,这样在浓缩胶和分离胶的交界处,加样空下部的蛋白会走的很慢,上部的跑的快,这样在交接车蛋白就聚集了,这就达到了蛋白浓缩的目的了,这就是浓缩胶浓缩的原理,到了分离胶后,在调高到正常的电压或者电流,就行了。
3.31KD以下的蛋白是否量很少?还是很容易降解?为什么考马斯亮蓝染色条带几乎看不到?
至于量的问题,很难回答,不同的菌或细胞是不一样的。一般小分子量蛋白是比较容易降解,特别是浓度比较低的时候。考染看不到只能说明你的样品中蛋白很少或者没有。因为你的其他蛋白都能染色,至少说明你的染液和染色方法没有问题。
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qianqin1977[使用道具]
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多楼上战友的指点。不过还的继续求助
1.因为胶还的继续转膜,所以怕转膜的时候溴芬蓝把膜给染了,我试试看能不能洗掉?
2.浓缩胶我是用10mA跑,分离胶15mA
3.蛋白量我都上到70ug,
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请问上样buffer的配方?
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gemei0115[使用道具]
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先重新配胶跑一次,5%的要厚一点,便于分离。再用一个能表达蛋白做阳性。要是别的蛋白 35kd那里也没有条带的话,建议换上样buffer .换dtt变成巯基乙醇试试看。
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1.因为胶还的继续转膜,所以怕转膜的时候溴芬蓝把膜给染了,我试试看能不能洗掉?
没问题,我们有时候都不洗,直接转膜就行了,不信你可以一试,最后膜上肯定很干净的,那些蓝色已经被转到上下的滤纸上了
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1.溴芬蓝和目的条带位置相近怎么弄啊?
溴芬蓝在后续的染色脱色中是可以洗掉的,只要时间够长。所以没关系。
2.跑胶的时候,浓缩胶没有将溴芬蓝浓缩成一条线,大约要指宽,是如何回事?我5%浓缩胶,分离胶是15%。
浓缩胶没有将溴芬蓝浓缩成一条线是因为你的蛋白上样缓冲液中的GLY降解了,应该重新配tris-gly上样缓冲液,并重新调tris-hcl 6.8;8.8的PH值。
3.31KD以下的蛋白是否量很少?还是很容易降解?为什么考马斯亮蓝染色条带几乎看不到?
不了解。本来应该用15%就可以将其和溴芬蓝分开,但你的很可能是小分子蛋白都聚在了一起,也就是溴芬蓝所在位置,没有分开。所以染,脱色看到最前面的条带特浓。
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qiangren789[使用道具]
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今天又跑了一下,做了如下改动:
蛋白上样量降低降为50ug,浓缩胶也能浓缩成一条线了,可能是上样量大了也影响浓缩效果。1和2泳道是以前提的蛋白,可能小分子量的蛋白降解了,4、5和6是重新提了蛋白31KD的蛋白也能看到。对于溴芬蓝我再想能不能不加啊,它是一个指示剂的作用,我每次加MARER行不?我的蛋白是用1XSDS上样缓冲液提取的,上样前才稍加一点溴芬蓝,不知道行不行?给位战友指点一下


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不可以不加,主要是你的上样缓冲液主要起两方面的作用:
首先你所谓的不加溴芬蓝是说不用上样缓冲液吗?如果不加上样缓冲液,那是万万不行的,你的缓冲液还有促使蛋白溶液的比重增大,你没有发现上样的时候,加进去的样品立即就往下沉到插槽空的底部了吗。
其次是溴芬蓝作为指示剂,显示蛋白跑到哪里了,不要跑过了但也不要跑的太短。
这点当然如果有marker也可以指示,只是你的marker是一个指示剂,里面也含有溴芬蓝,而为了能更好的作为control显示你的分子量,你的样品中最好也有和marker中一样的除蛋白外的成分。这样才符合科学合理的实验对照
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qianqin1977[使用道具]
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我提取蛋白是用1XSDS上样缓冲液提取的,只是还没加溴芬蓝
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