【求助】请教小分子蛋白WB

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标题:【求助】请教小分子蛋白WB

shkudo[使用道具]
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发表于 2014-3-5 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做L-FABP（13-14KD）WB，用过12%和15%的胶，半干转，10V 20-30min，一抗是abcam公司的，没给出具体的效价，用过1：3000，1：2000，1：1000，rabbit，有孵育2小时过，也有4度过夜过；洗膜10min×3次；二抗羊抗兔1：5000，1h，洗膜10min×3次，ECL发光3min，结果有时背景有些黑；有时什么也没有，很干净的一张胶片，有那么两次隐隐约约有条带，但是不清楚。
另外想问下各位高手，我用的是以前跑2-DE时提的肝组织蛋白，提取方法对小分子蛋白有影响吗？难道是我标本的问题，但跑普通的SDS-PAGE，未见明显的蛋白降解，只是下面小分子量的蛋白条带很细，再往下就（大概几KD）模糊了，感觉有点降解。
请各位指点！谢谢！

北国毛毛雪[使用道具]
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发表于 2014-3-5 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也做14KDa的小分子量的蛋白，用4%和12%的胶，湿转，100V，30min和11.5h，都试过。一抗，二抗，DAB显色。28KDa的倒是能染出来。只是14KDa的膜上一直是没有条带。
请教高手指导，谢谢。

ero11[使用道具]
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发表于 2014-3-5 16:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做过7KD的蛋白
15%分离胶，5%浓缩胶
80-100V跑浓缩胶
100-130V跑分离胶
湿转，300MA、1h
封闭：5%脱脂牛奶1h
一抗：室温1h或4度过夜
二抗：室温1h
供参考

avi317[使用道具]
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发表于 2014-3-5 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1楼说的比较模糊可能时因为现在的温度比较高的原因加ice估计可以解决
3楼说的没有带可能时样本 1抗 2抗中的1 2 3的原因
你们的问题描述的不是很清楚···

49888[使用道具]
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发表于 2014-3-5 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是做不到12KD的小蛋白，用的是16.5%的分离胶，电泳用的80v，大约2小时，湿转200mA 40min,转移缓冲液中含有25%甲醇，用的是PVDF膜，结果膜用丽春红染色后17KD以下的条带就非常不明显了。BSA室温封闭3小时，一抗4度过夜，PBS洗膜3*15分钟，二抗室温1小时，PBS洗膜3*15分钟，显影后的结果也是非常淡，与背景不易区分。不知道有什么方法可以改进，还请各位指教

北国毛毛雪[使用道具]
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发表于 2014-3-5 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1楼说的比较模糊可能时因为现在的温度比较高的原因加ice估计可以解决
3楼说的没有带可能时样本 1抗 2抗中的1 2 3的原因
你们的问题描述的不是很清楚···

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请问您：
你说我可能是样本 1抗 2抗中的1 2 3的原因。123是指什么啊？

北国毛毛雪[使用道具]
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发表于 2014-3-5 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也做14KDa的小分子量的蛋白，用4%和12%的胶，跑1小时40分钟，湿转，100V，30min和1.5h，都试过。一抗（1：200）4°过夜，二抗（1：2000）一般摇床4小时，TBS-T洗膜3次TBS1次后，DAB显色。说明书上有2条带子，一个是28一个是14。28KDa的倒是能染出来，还有一条40KDa左右的。染色后膜上14KDa的一直是没有条带。
请教高手。谢谢！

北国毛毛雪[使用道具]
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发表于 2014-3-5 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对了膜是PVDF。