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标题:【求助】酵母表达——玻璃珠振荡破碎细胞问题

zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酵母表达——玻璃珠振荡破碎细胞问题

在酵母表达表达时遇到问题：
1. 少量表达时用玻璃珠振荡的方法破碎细胞，跑胶时蛋白量总是很低，有什么好的方法进行少量酵母细胞的破碎吗？
2. 好像有一种试剂加到玻璃珠振荡破碎的酵母细胞样品中来镜鉴细胞是否破碎的，是什么试剂啊？
多谢指点！
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酵母是比较难搞。
我是超声1个小时。
你的酵母的表达的目的蛋白不再培养基上的？
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道楼主用毕赤酵母还是酿酒酵母，酿酒酵母表达量本身就比毕赤酵母的表达量低很多，更不要说和大肠杆菌比了。
我们用的是酿酒酵母，并且是用锆珠破碎的，个人估计和用玻璃珠破碎的原理都一样：
我们采用的是将酵母离心后用纯水清洗一遍离心，弃上清，加上细胞裂解液，以及差不多等量的锆珠，然后震荡2min，放冰上2min，如此循环五次，最后离心收集上清，然后再加入裂解液，重复上述步骤裂解震荡一次，将两次上清混合，再加入带有谷胱甘肽的亲和beads，4度过夜离心，收集beads，洗两次跑胶就可以了。
我们从来不看酵母在显微镜下是否破开了，一般只要不犯严重错误，都有目的蛋白的。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢两位！
我用的是粟酒裂殖酵母。关键是感觉玻璃珠破碎效果很差，上清中总蛋白量很少。想问一下sguang711战友，细胞裂解液是否会影响蛋白活性，裂解液的成分是什么？
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
裂解液就是一般的，含有tris，trixon-100，EDTA，NaCl等。
另外还要放一些蛋白酶抑制剂如PMSF等，防止裂解过程中被酶降解。
应该不会影响蛋白活性，我们表达激酶都是用这种方法，还有活性。
由于酿酒酵母产量本身就很低，所以我们还要用亲和珠子去纯化，然后再跑电泳。
不知道你的目的是做什么用的，如果是做抗体的话，最好不要用酵母表达。量太低了。
最后，所有的操作都要到4度或者冰上操作，以保持蛋白活性，并降低一些酶的活性。
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H2O[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

裂殖酵母是比较难破碎的，其细胞壁十分坚韧。不过你用glass beads 不应该恨困难。
方法如下
sample 与glass beads 等份混合，用专门的homogenizer 2500rpm2-3min 可以是70-80%的细胞破裂，之后你可以镜检，若不完全，再补充一分钟。
破碎在4度进行，且加入蛋白酶抑制剂
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢各位的指导意见！本人表达的是核酸酶，并检测其活性，由于有120KD多，原核表达尽是包涵体，所以只能酵母表达了。
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酵母一般可以用蜗牛酶降解。
我们在抽酵母DNA时，用glass bead混匀后，在涡旋振荡器上震荡30min以上。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-3-5 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上说的方法对付出芽酵母ok，但是fission yeast much more difficult
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