蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】重组表达酶无活性

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 14  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】重组表达酶无活性

cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
1

发表于 2014-3-7 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】重组表达酶无活性


大家好，我在大肠中重组表达（带His tag）了一个古菌的酶，得到了可溶性表达，但是纯化后做酶活性检测，却没有活性。
补充说明几点：
1，该酶为嗜盐古菌中的酶，在测活时已经把盐浓度增加了，并做了浓度梯度。
2，可溶性表达，且表达出的融合蛋白大小与预期相符。
3，测定活性的体系借鉴在其他相近的嗜盐古菌中成功的体系。
问题：
1，如果要得到有活性的酶，应该采取什么措施？或者可以尝试什么方法？
2，采取亲和柱纯化时，是否可以把盐浓度增加（到4M NaCl）,这样对柱子有什么要求或者损伤吗？
期待您的建议和idea
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
2

发表于 2014-3-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的酶蛋白有没有特别的高级结构和修饰，表达是表达了但不会形成你想要的结构，即便你表达出来有活性有可能在纯化过程中失活了也有可能，4M的NaCl简直太夸张了，一般《0.5M，两方面，表达方面优化，可以考虑和一些促折叠的片段融合表达，或选用一些特殊的宿主菌；纯化方面考虑添加一些保护性的添加剂b－ME，甘油！
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
3

发表于 2014-3-7 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4M NaCl对于嗜盐古菌来说是很正常的。
楼上说的很对，是没有形成正确的折叠才得不到活性产物，针对你的提议，我有几个疑问：
1，如何知道该酶蛋白有没有特别的高级结构？是不是用什么软件预测？
2，在纯化时加保护性添加剂是怎么加的？原理呢？
谢谢你的热心帮助！期待你继续赐教。
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
4

发表于 2014-3-7 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您的基因序列是做RT-PCR得来的还是基因合成的呢?
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
5

发表于 2014-3-7 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DNA序列来源于模式菌基因组测序后提交的序列，经过PCR扩增得到，在大肠杆菌中表达得到重组融合蛋白。
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
6

发表于 2014-3-7 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 cbou876 于 2014-3-7 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

4M NaCl对于嗜盐古菌来说是很正常的。
楼上说的很对，是没有形成正确的折叠才得不到活性产物，针对你的提议，我有几个疑问：
1，如何知道该酶蛋白有没有特别的高级结构？是不是用什么软件预测？
2，在纯化时加保护性添加剂是怎么加 ...

4M NaCl非常不利于层析纯化。
1.如果你有正确构想的有活性的高纯度酶，可以将你重组表达的酶和有活性的酶做个CD 看它们的高级结构是否一致！如果没有有活性的酶，很难知道你表达的酶的构想是否正确，即便是知道他的AA序列。一般的高级结构预测软件是在已知AA序列的情况下预测它可能的三级结构，与该实际的存在形式没有直接联系。
2.加入酶的抑制剂可以保护酶，免遭蛋白酶酶解；加入甘油可以防止蛋白聚集或者出现沉淀，保护它的正确构想；加入beta ME可以保护二硫键的正确构象，保留活性（2硫键一般与蛋白活性紧密相关）
顶部
66+77[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75637
精华 1
积分 596
帖子 785
信誉分 103
可用分 4751
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
7

发表于 2014-3-7 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
DNA序列来源于模式菌基因组测序后提交的序列，经过PCR扩增得到，在大肠杆菌中表达得到重组融合蛋白。

=========================================

哦,RT-PCR得到的就不存在我那个问题了
我有个蛋白,基因合成就不行,用原序列就有活力,呵呵
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
8

发表于 2014-3-7 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

碰见这种情况很正常，否则任何功能蛋白都可通过表达获得了，这也是基因工程的瓶颈。
一点建议：
1.更换表达载体（his有可能影响功能）或表达体系
2.试用不同的宿主菌
3.优化表达条件，不要一位追求高表达
4.纯化时注意柱子的平衡问题
5.确认该酶活性条件之一是4M的NaCl环境？若是，你的表达体系可能就已不满足条件（如高盐条件下的蛋白折叠、修饰等），极有可能一般的表达体系只能获得部分功能（最不幸的没有你想要的功能）
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
9

发表于 2014-3-7 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先非常感谢大家的热心帮助。我现在正更换表达宿主，将原来的Rosetta换成更有利于胞质二硫键形成的Rosetta-gami,同时再优化表达条件，希望能获得活性酶。
针对大家的回帖，我存在以下疑问：（继续学习ing）
1，站友所言甚是，但我不懂“4.纯化时注意柱子的平衡问题”，能再给点详细点的信息吗？
2，楼上给的建议中，我属于后者，即没有可以知道的活性正确折叠蛋白。另外，在纯化时加这些保护剂是选择性加，还是都加，能否给出相关的参考文献或者资料，这方面不是很懂，需要学习，希望能给点帮助。
再次感谢各位。
顶部
33号[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74277
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4611
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
10

发表于 2014-3-7 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
柱子平衡问题：主要是指柱子能否用最接近酶活性条件的情况下平衡，然后进行纯化蛋白，否则纯化和功能的研究环境不一致，可能造成蛋白纯化时无法保持正确结构，或功能研究时蛋白结构又发生改变。
注：都是可能，你可以设立对照试试，碰运气吧，未知因素太多又不可控。
祝实验顺利。
顶部
 14  1/2 12››