液相色谱

第一次用HPLC定量,得出无法解释的结果,请各位大侠帮忙.

用A物质标准品(固体粉末),ddw制成0.5mg/ml溶液，分别进样5ul，10ul，15ul，20ul，25ul，30ul，50ul进行HPLC，根据标准品HPLC检测时的峰高，制得峰高与进样量关系的标准曲线y=31.286x+609.64(R2=0.98)。

将待测样品X（固体粉末），ddw制成0.5mg/ml溶液，进样10ul（质量为5ug），HPLC检测，A物质的峰高为1280.1，根据标准曲线的计算得HPCL检测的10ul X样品中A物质的含量为21ug,可是X物质进行HPLC检测时，进样总质量不过5ug,A物质在其中的含量怎么可能为21ug（〉5ug）呢？

目前，我能够想到的原因：

1，样品配置的时候出现了问题：
但是，A和X物质同时进行称量、配制，都是取20mg样品，溶于200ul ddw，配成100mg/ml母液，然后取5ul母液ddw稀释至1ml,配成0.5mg/ml的检测溶液。如果配制过程有问题，那么两种物质的溶液浓度就会都有问题，不会两者之间有这么大的差异。

2，X样品在A吸收峰的地方，还有另外一种物质的吸收峰：
但是，HPLC的条件（流动相中有机相和无机相的配比）做过多次改动，X物质中A物质出峰时间与A物质标准品的出峰时间总是一致的，没有看见X物质的A峰周围有其它峰出现；并且，X物质的A峰，很犀利，不像夹杂有其它物质。

不知道还有什么问题，我忽略掉了，没有注意，请各位大侠指点。

[ 本帖最后由 youngturtle 于 2010-8-12 14:29 编辑 ]

本试验也用峰面积作过标曲，R2=0.95；而用峰高作标曲时，R2=0.98,线性更好一些。所以后来的试验用的是有关峰高的标准曲线。
另外，即使用峰面积的标曲计算，还是得到同样的结果。
请各位大侠指教。

基线不是很平啊，而且这条件出峰太快了，感觉你的样品峰前面有一些杂质，所以造成你计算的结果变大，另外检测波长最好能调一下

朋友，把标准曲线的原始数据发上来。

可以肯定你的标准曲线不好，截距过大。不符合要求。

weight(ug)        height
       
5        721.2
7.5        861.3
10        945.4
12.5        1011.8
15        1090.7
25        1373.9

以上是做标曲的原始数据
请大家指教~

HPLC整个过程采用梯度洗脱，条件是:
time(min)                     乙腈（%）      0.05%三氟乙酸（%）
0                                         10                                    90
8                                         18                                    82
8.1                                      100                                 0
12                                       100                                 0
15                                        10                                  90

210nm检测

[ 本帖最后由 youngturtle 于 2010-8-12 13:22 编辑 ]

从峰面积线性较差和谱图可以看出
1。样品好像在死体积附近，分离定量不太准
2。谱图积分不太正确
3。做曲线用不同进样体积不合适，毕竟体积不同，峰展宽不同
改善分离条件，如使用离子对是试剂

现在都反对进样量不同来做标曲的做法，因为定量环不一定完全准确。做标曲都使用配制梯度溶液进样相同量来操作。

基线走的很不稳啊，是13.8min左右的峰吗？
你计算时的稀释倍数搞清楚了没？

首先这位朋友的计算好像是有点问题：根据线性公式10ul的进样量的峰高应为922.5,10ul的进样量相当于5ug样品，因此，兄弟实测峰高为1280.1，计算出的样品量应该为1280.1/922.5*5=6.94ug。所以，你算的32ug不知道你怎么算的。

其次，兄弟做线性的方法个人觉得不是很准确，一般的做法为峰面积或峰高对样品的浓度进行线性回归，你应该配制不同浓度的样品，统一进样量然后做线性。因为你用微量注射器定量本身就不准确。

最后，你的色谱条件也不是很好，应该先看下重复性是否能够满足要求。