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标题:【求助】P-AKT的抗体浓度

qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】P-AKT的抗体浓度

我刚买了cellsignal的p-akt抗体，请问做过它的western的朋友,一抗和二抗分别多大浓度ECL发光效果好一些
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小糖块[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

p-Akt我前一段做过，一抗和二抗的浓度我都是用的1：2000，觉得挺好的，你不妨试试。
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小糖块 于 2014-3-8 09:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

p-Akt我前一段做过，一抗和二抗的浓度我都是用的1：2000，觉得挺好的，你不妨试试。

请问小糖块,你用的也是cellsignal的抗体吗
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glass[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
p-akt(ser473) cell signal 1:1000,条带不是非常强
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问二抗多大浓度？？？
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glass[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qumm1985 于 2014-3-8 09:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问二抗多大浓度？？？


二抗1:2000 rabbit,
后来又做了一次，这次压片压了2小时，条带很粗，一抗也是1：1000，
条带不是很强的那次，压片15分钟
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

恩，谢谢。我明天再重敷一下抗体，今天二抗1：4000，没有发出来
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发表于 2014-3-8 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做磷酸化的AKT的WB,想请教glass一下，我做是
3%BSA封闭室温摇床1小时，
一抗TBST 1:1000 4度过夜,
TBST洗半小时
二抗TBST1:3000,
再洗半小时
曝光 结果出来背景非常高，几乎整张片子都是黑的了，不知道是怎么回事？？
很郁闷，曾想是不是二抗浓度高了，可听你1:2000都可以啊。或是封闭有问题还是一抗呢？ 请指教谢谢！！！
另外再提蛋白时是否需要蛋白酶抑制剂呢？
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发表于 2014-3-8 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做P-AKT还有AKT，郁闷的是做了两个月还没有出条带，都快郁闷死了。有哪位做的好的，能不能介绍下经验啊
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可采用封闭至少两个小时以上，可降低背景。
一抗用1:1000, 二抗用1：3000，是可以的。
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