【求助】质谱鉴定之困惑

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标题:【求助】质谱鉴定之困惑

chenshuanhe[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问用质谱法鉴定一个能抵抗胰腺蛋白酶消化的蛋白（比如表皮生长因子），能弄得出来不？如果能出来，会不会有影响？
质谱都要经过胰蛋白酶消化，胰蛋白酶能不能消化任何蛋白？
请指教！

DNA[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白变性之后应该都可以用胰酶的吧，不很确定。
也可以不用胰酶，top-down路线

chenshuanhe[使用道具]
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发表于 2014-3-8 09:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

什么是top-down路线？？

orangecake[使用道具]
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发表于 2014-3-8 10:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

直接把蛋白质热变性
再胰酶消化
top-down不好做

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-3-8 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Topdown要求的是傅里叶变换FT-HRMS，1000多万一台哪。。。当今最牛的是UIUC的Neils Kellar，据说在美国只有他一个能做。。。不过我们组曾经到上海生科院送过一个10kD的蛋白做topdown结果非常好，哈哈中国的科技水平很高啊

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-3-8 10:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

top-down不同的人有不同的解释，现在比较被广泛接受的解释的是：完整的未经酶切的蛋白直接进MS，就叫top-down，由于分子量很大，修饰更加复杂，所以难度很大，但是也保留了更多的蛋白特性。一般都使用高精度质谱，orbitrap和FT之类的，现在也没有那么贵了，orbi报价也就70万美金左右，国内现在装的很火爆的。但是我感觉蛋白变性之后，酶解是没有问题的，所以可以先走bottom-up

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2014-3-8 10:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

曾经做过一段时间的top down,我们当时用的是LTQ-FTICR的ECD，说一下体会，（1）对样品的纯度要求比较高，所以我们当时并没有用实际的样品，而是用的标准蛋白质。（2）分析的蛋白质不能很大，大概20 Kda左右吧，太大的蛋白质需要带上更多的电荷才能在质谱检测范围内。（3）最麻烦的是谱图的解析问题，topdown 得到的谱图是相当复杂的，而且用了ECD，所以离子种类很复杂，带电状态也很复杂，目前国内还没有软件来解析这些图谱，当时我们是在Kellar实验室的网站上申请了账号才用他们的软件解析的，有些结果不错，有些结果不是很理想。
质谱实验室或蛋白质组实验室有条件的话可以展开一些这方面的基础研究。