小中大【1】你转膜后预染marker各个条带都可见，说明转膜没有问题。
【2】感觉还是用试剂盒好一些。
【3】可以适当减少电泳的时间。
电泳时间是：积层胶120V、30min。分离胶（15%）用是140-180V，80-120min，转膜是300mA、90-100min。用过两层层叠的NC转膜，使用90min是在marker11KD最小处有小量蛋白转到第二层膜上。
你的内参分子量是42KD左右吧？你的目的蛋白的分子量偏小，可以缩短转膜时间，建议试一下300毫安半小时。
【4】测过蛋白浓度吗？蛋白浓度是多少呀？如果蛋白浓度不是很高，上样量不是很大的话，可以增加上样量，增加蛋白浓度。
我们通过测定OD260和OD280的比值初步决定蛋白浓度，一般都是在3-6mg/ml（应该是这个单位），所测的蛋白表达量也是高表达的，这个蛋白浓度做出来应该没有问题，内参都有很好的表达。
蛋白浓度不是很高，不知道你一般上样量是多少，把上样量加到100微克左右试一下，当然也可以适当增加蛋白浓度。
【5】增加一抗浓度，增加一抗孵育时间。
一抗使用的是 Santa Cruz的，在用1：200的时候背景很多，在1：300时就没有什么背景，所以我们选择的是1：300。孵育的时间是4°C过夜，一抗洗涤的时间3X20min，二抗室温下孵育4h，洗涤时间是3X30min。
孵育的时候最好在摇床上进行，这样效果好很多。一抗稀释最好用封闭液（5％的脱脂奶粉）。一抗的洗涤时间可以缩短，一般3×5分钟就可以了。二抗室温摇床上1小时就可以了。二抗洗涤时间3×10分钟就可以了。
【6】增加显色时间。
显影用的是ECL试剂盒，国产的，不过检测其他的蛋白都效果很好。一般都是吹打一分多钟
【7】增加曝光时间，可以曝光很长时间的。
曝光时间是20-25min
这么长的时间一般足够了。如果荧光强，曝光几秒钟就可以了。如果弱，可以把压片暗盒用黑塑料袋包起来，放到抽屉里，然后长时间曝光（几小时）。
【8】当然是0.2μm的膜好一些，但是18KD的蛋白用0.45的膜也可以的。注意转膜时间不要太长。
现在使用的是0.45umNC膜
通过上面的实验方法，还是没有检测到蛋白的条带。请问是不是蛋白容易降解的话就不容易检测得到，或是需要通过什么特殊的方法处理蛋白。
还有蛋白的二级构象会不会对蛋白的检测产生影响。
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既然你的内参曝光后条带很好，应该降解的问题不是很明显的。裂解的时候可以加入蛋白酶抑制剂，如果不放心可以同时加几种蛋白酶抑制剂。
