【讨论帖】大肠杆菌死亡破菌之后其胞内抗抗生素的...

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标题:【讨论帖】大肠杆菌死亡破菌之后其胞内抗抗生素的...

IAM007[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做一蛋白表达，是大肠杆菌诱导表达。
WB检测结果表明：
1。诱导前没有目的蛋白表达
2。诱导4h后，破菌上清、沉淀均有目的蛋白
3。诱导6h后，破菌上清、沉淀也均有目的蛋白
4。诱导过夜后，破菌上清、沉淀均没有目的蛋白
上述4个时间点的取样体积相同，破菌操作相同，上样量（体积）相同。
见下图
同室的博士提出下面的观点：虽然在表达过程中加有抗生素，但是表达菌中有些菌是不含带目的基因的质粒，到最后这种不含质粒的菌占优。他的这种观点是基于菌内抗抗生素的相关物质在其死亡破裂之后是可以进入到活的大肠杆菌内的。
本人是想这些抗性基因编码的活性物质多是些蛋白类物质，那它又如何通过大肠杆菌的？尤其是周质间隙的那两层膜？即便是过去了，其结构是不是也变了啊？不知这些抗性基因编码的活性物质的半衰期又是多少？

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2014-3-8 15:10

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wood533[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很奇怪的解释。。。没有考虑过，倒是一般的解释是由于时间过长产生大量蛋白酶，使蛋白降解了
不清楚，欢迎讨论，仅供参考！

IAM007[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也觉得不可思议，而同室的博士说这是板上订钉的事，没错．所以想请有经验的站友指点迷津

yychen[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我需要知道的是：1，你重复这个实验多少次？2，你的蛋白属于什么酶类？

gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2014-3-8 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我需要知道的是：1，你重复这个实验多少次？2，你的蛋白属于什么酶类？

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我的实验没有重复做，蛋白本身不是酶类。

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发表于 2014-3-8 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

诱导过夜的没做过，最长是诱导到8小时，4h,6h,8h,目的蛋白浓度一个比一个高，梯度明显。个人想不出什么理由。若是蛋白降解只要抗原表位没有破坏，western照样应该有结果吧？楼主可以试一下，看看低分子量处western有带没有（当然若是抗体太贵就当我没说）。
另外，楼主本身的问题我没大看懂。即便贵试验室的博士说的正确，即降解抗生素的酶类可以进入到其他菌体，这能解释wb无带的现象么？前六个小时积累的蛋白呢？

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我的蛋白上带有his-tag所以就用抗his的一抗（天根抗体）。
博士的观点是可以解释WB无带的：菌体生长到最后，不含带目的基因质粒的菌占优，这就是说大多数菌内不表达目的蛋白，而含有带目的基因质粒的菌在前六小时是表达目的蛋白，而后来就死掉了从而将蛋白释放出来到培养基了，我最后收集的菌即便有目的蛋白，但由于量少而检测不出。

831226[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2014-3-8 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人认为你们室博士的解释有点牵强啊!
如果是你们所说的那种解释的话,可以用实验进一步证实.诱导4,6,8h均可检测到蛋白,那么在随后的诱导时间内可以向培养基中追加抗生素以杀死不含目的基因质粒的菌,诱导完毕后再检测看结果如何.
若是因为降解了而检测不到也不太可能吧,WB很灵敏的,只要还存有ug级的蛋白即可检测到的,不会降解的一点都不剩吧!
为什么用WB的方法检测诱导蛋白呢?考染检测不到吗?建议跑个考染图看看总蛋白及目的蛋白或做个WB的内参对照,保证各孔的上样量再做考虑.
找到原因后记得回复个帖子,很想知道为何会出现该现象!
......

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就是因为考染看不到，才做的WB。通过WB我们估计1L的表达量在1mg左右。至于WB的内参，我们选用了以前纯化过的带His-tag的一个蛋白做相对内参。
另：his-tag 如果掉了的话，应该就检测不到了。我用的是抗HIS的一抗。
下面是以前做的诱导2h,4h的SDS-PAGE。可是分不清哪个是目的蛋白(软件测11kD，实际可看我上面的WB图)

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2014-3-8 15:19

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发表于 2014-3-8 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

后来直接就用Overnight autoinduction express instant TB medium 过夜培养了，接着就做了一步纯化，感觉效果不怎么样。
最后还是硬着头皮做酶切了，酶切之后也出现了一些问题，就是找不到酶切后的带了，都找不到方法来检测了。见下图：

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2014-3-8 15:20

11723754.jpg (34.88 KB)

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