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标题:【求助】实验没有结果 pvdf上没有看到丽春红染的条带

笑弯了腰[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】实验没有结果 pvdf上没有看到丽春红染的条带


我测一个大概110的蛋白 ，用的是8%分离胶，4%浓缩胶，电泳浓缩胶是40v 大约1h
分离胶 100v 1h 然后是湿转 300mA 2-4h都实验过 ，然后是丽春红染，然而没有看到染色上的蛋白条带 ，接下来tbst洗后脱脂牛奶封闭 1h ，1抗4度过夜，tbst洗，2抗室温1h，显影 ecl ，没有看到任何东西 。
请各位大大帮帮忙，分析下那里出了问题 ，另外我跑过gapdh也没有看到条带。
但是在电泳后的胶用考马斯亮蓝染后可以看到很多很清晰的条带。
最后还有几个问题 ，1 如何是确定蛋白提取没有问题，2如何确定1抗 ，2抗是合适的。以及其合适的比列。
紧急求救。请各位大大帮帮小弟，小弟在此多谢了
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阿k[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们用的是10%浓缩胶，电泳100v，2个半小时。
转印200ma，50min。
丽春红不一定都会出来。
蛋白要测浓度的。
1抗2抗看说明书啊
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发表于 2014-3-8 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人感觉你转膜过头了,也就是你的目的条带可能已经透过膜损失掉了,建议跑个彩色的蛋白marker,缩短转膜时间,看看膜上有没有marker彩色条带,如果没有,很可能就是因为转过头了.我们一般恒流150mA,1h,每次效果都很好,建议试用,祝好.
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发表于 2014-3-8 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我就是用的彩色的mark
现在我用半干转 。2小时-3小时，mark都很清晰的转在膜上 ，但是最后显影都没有东西。另外我同样的方法 半干1.5小时，很清楚的做出了gapdh
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如何是确定蛋白提取没有问题
跑sds-PAGE,考染
如何确定1抗 ，2抗是合适的。以及其合适的比列
可以做个dot-blot ，点你的样品在膜上，然后按western转膜后的步骤作。一抗二抗分别按梯度稀释，以确定抗体效价。其实从公司买的抗体，一般不用做这个，因为条件都是公司已经摸好的，按说明书作就行。
1。半干转15v -20v ，1.5小时足够了。
2。110kd如此大的蛋白对0.45的膜来说不太容易转过。
3。我觉得你用10%的胶更合适，甚至12%的都可以
4。除了用marker以外，你也可以观察转膜以后的膜表面，是否有蛋白的印迹，来确定转膜是否成功。
个人觉得不像转膜的问题，而且内参都砸出来了，说明样品应该是好的。
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发表于 2014-3-8 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位大大。
我测过蛋白，大的有4 ug/ul 1.8ug/ul 2个、
每次转膜后，我都把转过的胶放去用考马染，发现有时候是有蛋白条带有时候没有 ，不现在调到4h了 ，
另外我每次上样都是20ug的蛋白，我想是不是能把蛋白量加到50
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的开始采用300毫安，2小时 三小时 四小时都没有转上或者是转过了，现在采用恒压30伏 转16小时，之后用丽春红染色可以看到漂亮的条带，marker 也很好，你可以试一试，祝顺利。不过我的WEST也只做到这一步，可能抗体不行，没有得到最终结果，共勉吧
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-3-8 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白的大小是94KU左右
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 小中大

哎，我今天用湿转的方法 ，400ma 转6小时
然后是1抗过夜 ，看明天结果如何
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