小中大【求助】WB中的问题，老做不出来，头疼
各位好，我现在遇到的问题是，立春红显色后效果很好（师姐和实验老师都这么认为），虽然不知道蛋白条带（45KD）的具体位置，但是比对Marker还是可以感觉到那部分的条带很清晰的。但是我始终做不出结果，现把步棸详解如下，希望大家帮我分析一下：
1，封闭（5％的脱脂奶粉）一小时，室温下摇床上进行。
2，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。
3，孵育一抗（cell signaling，单克隆抗体），比例是1:1000(说明书上标示)。先室温摇床上1小时，再放在4度冰箱过夜。
4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。
5，孵育二抗（博士德），比例是1：5000（我用的说明书上的最大标示）。室温摇床2小时。
6，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。
7，加入pierce显色试剂（按说明书要求进行）。
8，曝光5分钟，显影（至今为出现目的条带），定影。（把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。）
