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标题:【求助】做的胶过夜行吗？

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做的胶过夜行吗？


因胶凝的慢，做的胶能不能过夜，第二天再上样？因害怕加太多AP不好？
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做好的胶，4℃过夜没问题。聚合过夜没试过，可能不好。
胶凝的慢主要可能有3方面原因：
1.试剂问题
AP尽量用近期的（我一般用4℃保存半个月内的，没出过问题）；TEMED时间较长的，特别是有较浓的氨臭味的，可多加一些（我们实验室的TEMED有3-4年了，我一般加5-10倍文献上的量）。AP对聚合速度影响较小，可以多加一些，聚合速度和AP浓度的平方根成正比，与TEMED浓度成正比。
缓冲液pH值，不同pH值胶聚合速度差异很大。
2.温度
胶在25~35℃聚合较好，温度过低胶较脆和浑浊，温度过高易造成聚合不均匀且易产生气泡。（冬天易出现不易聚合的情况，放在培养箱里聚合即可）
3.封口
分子氧会阻碍聚合，一般加蒸馏水或异丙醇等封口。
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

聚合过夜没有问题，我们经常制备好凝胶然后放在四度冰箱保存1～3天，经过SDS-PAGE后电泳结果基本没有影响。不过要是结果要求较高的，建议还是现配现用为佳。
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，TEMED不能添加过多，否则凝胶形成不均匀，对实验结果影响很大，同时会增加凝胶的脆度。
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢，那我就不要凝胶过夜最好，不过要费时间。再问一下，AP可以多加多少呢而不影响结果呢？
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

AP不用做很大的改变啊，加大TEMED就可以了。温度低时用文献上的翻倍量；温度高时用文献推荐量。我的分离胶大约20分钟凝好，浓缩胶稍长一点，要等完全凝好了再拔梳子进行后面的步骤，否则浓缩胶容易被扯出裂隙，好好的一板胶就废掉了。
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分离胶凝久些好，一般40min以上，这样分离效果好些！浓缩胶凝的一般快些，一般半个小时（可能还不用，但为了确保胶能凝好，宁可多等会儿）就可以了，至于胶过夜，我觉得没什么问题（不过得用保鲜膜包下放4度冰箱）；或者你可以先灌分离胶（水封多点,防止胶面干掉），然后第二天在灌浓缩胶，这都没问题。我用过放了三四天的胶，也没什么异常。
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00无名指00[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做的胶搁4度放几天没有问题。我们是在胶孔里加满水或者电泳缓冲液，或者干脆不拔梳子，放塑料手套里扎口。一个礼拜左右都还可以用的。不过用之前你要注意看一下分离胶和浓缩胶的交界面，放时间长了这里容易出气泡。有泡的孔就不能用了，没泡的接着用。
当然，如果你样品比较珍贵或者要做WB检测，建议你还是最好用现配的或者配好一两天的。
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发表于 2014-3-8 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也试过，做好的胶，4℃过夜没问题。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-3-8 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的胶都做好放塑料袋中加少量水，室温放置，第二天再用都没有问题的
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