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标题:【求助】蛋白表达奇怪现象，急救！！

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发表于 2014-3-10 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达奇怪现象，急救！！


今天做蛋白表达，菌体OD达到1.0开始加iptg诱导，四个小时菌体OD值就酶变，而对照组未诱导的菌体OD达到3点多，这是什么原因啊？
怎么诱导后菌体一点都不长啊。
高手指点一下吧！！
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发表于 2014-3-10 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加入后表达的话会生长会很慢但一点不长不太可能，那后来跑电泳看表达了吗？你OD低点诱导试试或者降低点IPTG浓度，这种情况很有意思没见过！
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发表于 2014-3-10 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做了，但诱导的和未经诱导的，电泳条带没什么区别，而且条带也不清楚！
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发表于 2014-3-10 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我遇到跟你一样的问题，诱导前后做电泳检测没有任何差别，只是你比我还好点，我们实验室不能测OD值。我也没有解决的办法。
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发表于 2014-3-10 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先出现,这种情况不是坏事,蛋白应该表达了.
菌不长的原因可能是您的蛋白对菌的生长有影响,菌所有的能量都用来表达了,而不用于自身的繁殖了.
您的电泳图有吗?电泳的水平也很关键,最好跑薄的胶(0.75),分辨率高,您的这个蛋白应该是有毒性的,表达量不会很高,如果就想鉴定是否表达,可做western进一步鉴定.
祝您好运!
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发表于 2014-3-10 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电泳条带也不明显，表达前后差别不大，关键我要提取蛋白，表达两太低了，有什么方法能解决这种情况呢？出现这种情况还有可能是其他的原因么？例如诱导条件？
非常感谢你们的帮助！！
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发表于 2014-3-10 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

能贴个电泳图看看吗？
提取蛋白，蛋白量低也可以提取啊，您表达蛋白是什么啊？
表达量低，首先看您的目的蛋白是在上清，还是包涵体，如果是在上清可溶的话，您可增加诱导时的OD值，可达到１的时候再诱导，诱导温度可为３７度，诱导４小时，这个应该是最高的量了．
如果是包涵体的话，您增加表达量对您而言毫无意义！
实在都不行，只能换载体！
祝好运！
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发表于 2014-3-10 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这几天凝胶成像的仪器坏了 ，过几天再把图贴上。
目的条带不是很清楚，而且诱导的和未诱导的条带差别不大，
表达的是人心肌蛋白，表达的蛋白是分泌到周质空间的，蛋白在上清里的，
我也是再OD为1时开始进行诱导的，可是4-5h，分别测菌体OD值根本没有变化。
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发表于 2014-3-10 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 印花铅笔 于 2014-3-10 14:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这几天凝胶成像的仪器坏了 ，过几天再把图贴上。
目的条带不是很清楚，而且诱导的和未诱导的条带差别不大，
表达的是人心肌蛋白，表达的蛋白是分泌到周质空间的，蛋白在上清里的，
我也是再OD为1时开始进行诱导的，可是4-5h，分别测 ...

您是用的pET22b载体?
人心肌蛋白没做过这种,也就没有关于这类蛋白太多的了解和建议,您上一些蛋白网站,看过该蛋白的一些基本信息了吗?有人报道过该类蛋白的表达情况吗?用什么系统,您可查看一下,对您对实验的分析有很大帮助.
分泌的话,量应该本来就不会多啊,在我的印象里.
现在最关键的是看有无表达,有表达了，什么都好说,好做后面,因为您是作者.
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发表于 2014-3-10 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

文献上有人做过，用的体系也相差不大，载体都是PET载体，表达菌也是BL21，我们实验室现在也不能做western-blot ，电泳条带也不是特别明显，所以还不能证明蛋白表达，我想请问一下还有什么方法可以验证我的蛋白表达了呢 ？谢谢大家帮助！！
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