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标题:【求助】转膜以及蛋白提取问题

mickeylin[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】转膜以及蛋白提取问题


我用12%的胶，先是80V跑压缩胶，然后用100V跑分离胶，大概100min，之后就是湿转，100V转2小时。转膜后的胶用考马斯染色，有很清晰的条带，膜用丽春红染色，发现只有膜顶端上有条带（大分子量蛋白，80~200的蛋白，目标蛋白是28），其他地方都没有看到条带。想问一下大家，是否转膜后正常的话，丽春红染色会看到很多条带呢？我转2个小时，会否时间太长，都转过了吗？因为膜弄上一抗，二抗，再显色的时候是一片空白。
另外，如果小的那种细胞培养平，一瓶的细胞（大概1，000，000细胞）提取出来的蛋白只有1~200ug的话，是否提取不完全呢？我将细胞放在裂解液，冰上裂解2个小时再离心的，这样有问题吗？
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
１００Ｖ，３０ｍｉＮ都够了．．．．
你的目的蛋白才２８ＫＤ．．．
转久了,就只剩大分子量的蛋白在膜上了,其他的都被你转跑了
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hold住[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得象转膜不完全，因为只有大条带。根据我的经验，100v转2小时，6.5KD的分子都不会转过膜。建议你转膜时使用衡流，别用衡压，因为随着转膜时间的推移，即使电压不变，电流会逐渐减小。对于20KD左右的蛋白质，衡流（230mA）转30－50min即可；对于30－50KD（240mA）转60min；60KD左右（260mA）1.5h；大于80KD（300mA）2h。
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

啊？那到底是什么问题啊，到底是没有转过去，还是过头了呢？我发现转过膜后的胶染色后，也是大分子量那部分很蓝，小分子那部分很淡的蓝色。
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对了，恒压转膜的时候，那个电流大概在140-150mA之间。没有超过200mA的，是否因为用冰包着的缘故呢？而且我要看的另外一个蛋白，是116的，同样的条件，也是什么都没有。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于转膜，用不了猜来猜去。应该又预染marker一起跑，看它的转膜情况就基本上能判断其它蛋白的效果了。当然，局部气泡除外，这个需要丽春红来检测了。
简而言之，分子量在目的蛋白上、下的marker转移都能转上的话，目的蛋白也应该没有问题了。
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fox_79[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思，之前是借用我朋友的id（sarahguan921）发的帖。预染的maker是有转到膜上去的，但是为什么相应的目的蛋白，用丽春红染色的话没有看到相应的条带啊？
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发表于 2014-3-10 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你用恒流转膜，我们实验室一般是350毫安，像28的小分子两个小时就好了，时间过长分子量较小的都会转“飞掉”，就像你说的丽春红染后下面没有条带
maker的表达一般都强于你的目的蛋白，这和你提取的蛋白浓度有关，建议你测一下蛋白浓度
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发表于 2014-3-10 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

别在这里烦恼了，以下要点看能不能帮你解决点问题。
第一，先看你的PVDF膜是用的那种？是0.45的膜？还是0.2微米的膜。因为你目的蛋白是28KD较小，建议使用0.2微米的膜。0.2微米基本不会有蛋白转过。
第二，如果你用的是0.45微米的膜，那么你先前的湿转条件就过了，肯定会有很多转过去的。按楼主说的情况来看因该是0.45微米的膜，转过了。
第三，你用的玻璃板的SPACE是多厚的，1.5毫米的？还是1.0的？还是0.75的？这些都很重要，建议使用1.0的，这样用0.2微米的膜，100伏转100分钟足够了
第四，胶还是需要在转移缓冲液里平衡20分钟。转移缓冲液的配方是什么样的？有加SDS的，也有不加的。推荐：25mM Tris,192mM甘氨酸，10%甲醇（v/v)PH:8.3
以上都是细节问题，也很重要。楼上很多人说预染MARK可以看得出，也是不确实的，0.45微米的PVDF（法玛西亚）膜，对于预染MARK转的不是很好，但是蛋白倒转的是可以。楼上说的350毫安，像28的小分子两个小时就好了，如果他用的不是0.2微米的膜，早就飞的不见影子了。350毫安转1个小时已经足够了。
最后你裂解细胞，冰上20分钟裂解，再超声一下15秒就可以了，25平方厘米的瓶子加100微升的三去污裂解液足够了。
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2014-3-10 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢以上各位同志的热心解答！
我用的是0.45um的，但是之前我师兄也是这样做的，同样的细胞，看同样的蛋白，他就做出来了，但是为什么我按他之前的条件就做不出来呢？
还有，我用的是0.75mm space的玻璃板，实验室只有这种了。
胶转膜之前有在转移缓冲液平衡了5分钟。转移液是：25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH。
我之前有用过100V转1小时的，但是也是检测不到目的蛋白。
另外，我也觉得我的蛋白提取得太少，但是为什么呢？我也只是按别人能够做得出来的protocol做啊？
现在我是只能检测到其中一个是35kDa的蛋白，其他目的蛋白：23，28，47，57，116kDa均检测不出来。已经摸索了将近两个月了，真是不知道问题可能在哪里。实验室又没有懂的人了，真是郁闷！
我将今天的结果发给大家看一下，请大家帮忙分析分析。
蛋白上样量为30ug. 4%的压缩胶，12%的分离胶。80V 跑压缩胶，120V跑分离胶。然后湿转，100V 2hr。prestained那个marker因为是过期的，所以分的不是很清楚。


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2014-3-10 16:47
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