小中大你好：我很理解你的心情，因为我也出现过这种情况，我这几个月光做western blot 了，我在这里谈谈经验,希望对你有帮助，你近期的一个帖子我也回答了，你注意查看一下：
1。做western blot 时转膜是一个分水岭，用丽春红染色后（5‘）看条带有无或是否清晰，你所说的没结果到底是怎么个没结果。如果膜上没有条带或条带不清晰，那肯定是蛋白制样和转膜的问题。如果条带清晰而没有结果，就应该依次排除一抗，二抗，和ECL的问题，你抽几微升二抗点在一个新的小NC膜上，等二抗干了以后，连同要杂交的NC膜同时曝光显影，如果小膜上有黑点，而你要杂的蛋白没有条带，那肯定是一抗有问题，如果小膜上没有黑点，那二抗和ECL两者有一个有问题或都有问题。你也可以设计其它方法检测你的实验试剂和步骤是否没有错误。
2。封闭液最好用脱脂奶粉配，一抗用5％BSA加0。02％的叠氮钠在4度至少可以保存一个月，禁止反复冻融，二抗也用脱脂奶粉配，4度可以保存一个星期。
3。具体实验方法参见分子克隆第二版。
