蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】做WB快3个月了,目标蛋白还做不出来

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】做WB快3个月了,目标蛋白还做不出来

koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
1

发表于 2014-3-10 20:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做WB快3个月了,目标蛋白还做不出来


我做WB快3个月了,内参能做出来,暗室下能看到很明显的荧光条带,但是目标蛋白一直没从出现过影子,该怎么办?
我的目标蛋白54KD,内参是actin,做的是组织内源性蛋白.考染胶可看到较多的条带,很细较弱,转膜后丽春红染膜,整条泳道一片红,但是条带很少,只有几条,内参条带很明显,目标条带若隐若现.下面说说我的实验步骤,请大家帮忙分析分析,谢谢!
1.组织蛋白提取用的是碧云天试剂盒,蛋白浓度一般是2ug/uL左右,上样量30ug/孔.我用的是Bio-rad电泳仪,每孔只能上样20uL.
2.转膜15V,35min,Bio-rad半干转
3.5%脱脂牛奶封闭RT,1h;一抗1:1000或1:500RT 2h或4度过夜(倒扣法);二抗1:200RT 1-1.5h;TBST洗膜,10min*3次
4.ECL发光液(碧云天),内参和荧光标签都能做出来.
问题:
1.是不是我的组织没有我的目标蛋白?是否有其他办法能简单的检测我提取的总蛋白中含有我的目标蛋白,除外点杂交(我做过,暗室里面点蛋白的位置一团荧光很快就没有了,怀疑是假阳性)?
2.考染样品蛋白中条带也很少,很细,但是内参很明显,是否提蛋白也有问题?我的目标蛋白主要在核内表达,是否很难提到呢?
本来想上传图片的,压缩后图片还是很大了,传不了.没办法
大家帮帮忙吧,快疯掉了!
顶部
hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
2

发表于 2014-3-10 20:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
which protein do you used? total protein or nuclear protien? you should isolate nuclear protien to set up your Western Blot.
顶部
koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
3

发表于 2014-3-10 20:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是碧云天的Western及IP细胞裂解液,提取的蛋白应该是总蛋白.
楼上 是不是认为我应该用核内蛋白抽提试剂盒?这样的话,我用胞浆的actin做内参,是否合适?
谢谢指导!
顶部
koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
4

发表于 2014-3-10 20:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.是不是如果用核内蛋白抽提试剂盒来提取蛋白,就不能再用胞浆蛋白actin做内参了?
2.我做的是大鼠血管组织,文献上说体外培养血管壁上的某种细胞,目标蛋白主要在这种细胞的胞核中表达,胞浆也有少量表达,我是不是该提取血管全部细胞的总蛋白,而不仅仅是血管全部细胞的核内蛋白?是不是选用全细胞裂解液更合适?常用的RIPA细胞裂解液行吗?
期待各位高手的指导,谢谢!
顶部
feima+[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77651
精华 0
积分 424
帖子 547
信誉分 100
可用分 3561
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态 离线
5

发表于 2014-3-10 20:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没做过核内蛋白，不过据做过的人说他们都用的核蛋白提取试剂盒。
顶部
koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
6

发表于 2014-3-10 20:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面这张图是目标蛋白曝光后做不出来,洗干净后用丽春红染色.右边的Marker红色条带为72KD,其下面第一条为55KD,第二条为42KD,我的目标蛋白为54KD,但各泳道上55KD 的条带若隐若现,不知道大家做WB时丽春红染成这样能否用ECL做出来


查看积分策略说明
附件
2014-3-10 20:46
63124659.jpg (33.54 KB)
 
顶部
koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
7

发表于 2014-3-10 20:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是另外一张膜的丽春红染色,方法同上.但左边的Marker不同.上面的一条是80多KD的,下面一条为48KD 的,目标蛋白也做不出来.各泳道上明显的条带是内参actin


查看积分策略说明
附件
2014-3-10 20:47
73941009.jpg (23.94 KB)
 
顶部
koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
8

发表于 2014-3-10 20:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没转膜而直接考染的胶.左边能较清楚看到的是Marker泳道上的蛋白条带出了两条较明显之外,其余的都很细很弱.


查看积分策略说明
附件
2014-3-10 20:49
28231965.jpg (34.64 KB)
 
顶部
koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
9

发表于 2014-3-10 20:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充说下,上图左边的胶块中,位于右边的是Marker,很清楚.位于左边的是我的样品蛋白,泳道上除了两条条带较清楚之外(其中之一为内参),其余的都很细很弱,位于55KD附近的条带也是若隐若现的.相机拍得很不清楚,请原谅.这是不是说明我提的蛋白太少了?
顶部
koook5695[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74058
精华 0
积分 408
帖子 475
信誉分 100
可用分 3256
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
10

发表于 2014-3-10 20:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这张图中间的胶块是转膜后的.最右边的是Marker,泳道上蛋白残留的很少.左边的6个泳道都有不同程度的蛋白残留.大部分泳道上都能较清楚的看到内参条带的残留.这样的膜,我的转膜条件该如何调整?
最下面的胶块是没转膜而直接考染的.右边的是11KD~30多KD的Marker,各泳道上的蛋白条带都很少,是不是我提的蛋白有问题呢?


查看积分策略说明
附件
2014-3-10 20:50
55030215.snap.jpg (22.48 KB)
 
顶部
 12  1/2 12››