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标题:【求助】请问Tris在配胶中的 作用

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发表于 2014-3-10 21:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问Tris在配胶中的 作用

请问Tris在胶凝固中的作用是什么 ？
谢谢
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tudou85[使用道具]
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发表于 2014-3-10 21:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提供缓冲体系
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发表于 2014-3-10 21:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
【1】胶的组成：
10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶（两块胶，10ml） ～～～～ 4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水 ： 4.85ml ～～～～～～～～～～～～0.5ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）： 2.5ml ～～～～～ 0
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）： 0 ～～～～～ 1.26ml
10％SDS ： 100 微升 ～～～～～ ～～～～ 50 微升
10%AP（过硫酸胺）： 50 微升～～～～ ～ 25 微升
TEMED ： 5 微升 ～～～～～～ ～～～～ ～～ 5 微升
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
【2】说一下每种物质的作用。
凝胶主要就是丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺的过程。
（1）丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺：形成凝胶（聚丙烯酰胺）的基本物质。
（2）过硫酸胺（AP）溶液：相当于催化剂的作用。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
（3）TEMED：也起加速反应的催化剂的作用。催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
(4)Tris：主要是和蒸馏水混合，然后加入HCL，调节PH值，形成Tris•HCl，主要起胶的缓冲液作用。
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发表于 2014-3-10 21:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢!那Tris对胶的凝固起的作用是不是不大?
我的胶总是不凝,原因可能是Tris和丙烯酰胺,丙烯酰胺已经按分子克隆重新配过,但胶还是不凝.好难过啊!!! Sad 恳请各位分析原因.确定其他几样没错.
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发表于 2014-3-10 21:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶不凝主要是因为过硫酸胺（AP）或者TEMED加的量不够或者失效了。我以前也出现过这种情况，后来换了瓶AP就好 了。
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发表于 2014-3-10 21:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

AP可能性更大些，这个是配胶的组分里面，最娇气的
买一瓶新的，然后每次不要配太多，分装成一两百微升，大约就是两块胶的分量，放到-70度存放，每次就拿一管来用，不要反复冻融，配完胶就放回冰箱，不要一直放在外头
如果是冬天的时候不凝，可能只是温度因素，放到空调下面或者其他热的地方就好了。
另外好奇的文艺下，只是要缓冲的话，为什么一般都用tris?磷酸盐或者其他缓冲盐可以吗？
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发表于 2014-3-10 21:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哈，AP和TEMED相当于催化剂的作用，适当增加二者的用量，胶不凝固的情况就改观了。
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发表于 2014-3-10 21:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也碰到过不凝的现象，至今不明白，但是师兄把药品都重新配了之后就凝了，真是邪门.按理说我配得时侯是很小心的，应该没有配错的.唯一可能的原因就是设的PH值不太对.
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发表于 2014-3-10 21:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

APS聚合过程中作为引发剂，提供氧自由基，由氧自由基引发单体的丙烯酰胺形成自由基形式的丙烯酰胺从而与甲叉聚合，溶液常温易分解，一般4度，你j检查APS是否分解了；TEMED作为增速剂，它在中性和碱性条件下形成游离碱，APS只有在存在这种游离碱的环境中才能形成氧自由基，因此二者的浓度会影响到聚合，特别是TEMED的加入量甚少，有时我会遇到这种情况，用的枪头是国产的，枪头有的堵上了根本吸不到，另外就是枪头没套紧吸的量不对导致聚合很慢，你加时注意看有没有吸到或者加入胶时看胶的变化，TEMED和溶液的互溶不是很容易，刚加入会看到像在水中加油那种状态很容易分辨出是否加入了TEMED。另外就是Tris缓冲液的pH，酸性条件下TEMED无法形成游离碱，结果上面已介绍，还有就是温度，现在的温度没问题，试剂的纯度，我深有感触，以前用invitrogen的现在用其他牌的，反差真是太大，全方位的差距；还有分子氧，一般SDS胶用的试剂都未脱气，混匀时不要剧烈混合，枪吹吸即可，分子氧会阻碍碳链的延长从而阻碍聚合。
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-3-10 21:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

凝胶不聚合的原因
APS或TEMED的量不够，可增加催化剂的量
试剂质量差，使用电泳级的试剂
APS TEMED失活，配制新的储存液
聚合时温度太低
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